益心复脉颗粒改善增龄性窦房结功能减退机制研究

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中文摘要：目的：病态窦房结综合征（Sicksinussyndrome，SSS）与衰老密切相关，其发病率随人口老龄化逐年上升，缺乏有效口服西药治疗。窦房结退行性改变导致的增龄性窦房结功能减退（Sinoatrialnodedysfunction，SND）是引起SSS的重要机制。本研究采用心率显著降低的自然衰老小鼠构建增龄性SND动物模型，旨在观察益心复脉颗粒（Yixin-Fumaigranules，YXFMs）对增龄性SND小鼠窦房结功能障碍、窦房结组织损伤及窦房结起搏相关离子通道异常的改善作用，并从氧化及抗氧化角度出发，探究益心复脉颗粒与衰老、氧化、NRF-2/HO-1信号通路的关系，最后依托网络药理学及分子对接技术筛选益心复脉颗粒组方中能与NRF-2稳定结合的中药活性成分。旨在证实益心复脉颗粒不仅可提升增龄性SND小鼠心率，还可通过NRF-2/HO-1信号通路抑制衰老诱导的氧化应激，改善窦房结组织损伤及起搏相关离子通道异常，为益气养阴中药治疗SSS“上游调控”作用提供科学依据，为益心复脉颗粒“标本兼治”作用提供基础证据，为SSS的临床治疗提供更多选择。材料与方法：论文一 1.本研究从一批18月龄自然衰老C57BL/6小鼠中筛选12只心率显著下降的个体构建增龄性SND动物模型，随机纳入窦房结功能减退组（SND，n=6）及益心复脉颗粒干预组（YXFMs，n=6），并选取6只3月龄正常心率C57BL/6小鼠纳入对照组（Control，n=6）。YXFMs组小鼠予益心复脉颗粒灌胃，其余两组小鼠予溶剂（纯净水）灌胃。以心电图检测各组小鼠心率、心律及R-R间期评估窦房结功能；以Masson染色及胶原容积分数（Collagenvolumefraction，CVF）分析评估窦房结退行性改变，以TUNEL染色评估窦房结组织损伤；以窦房结组织DHE荧光探针染色及血清氧化应激因子检测评估氧化应激水平；以免疫荧光染色评估窦房结组织NRF-2蛋白表达与激活。 2.采用小鼠HL-1细胞系模拟窦房结起搏细胞，将HL-1细胞分为正常对照组（Control）、D-半乳糖诱导衰老组（D-galactose）、益心复脉颗粒干预组（YXFMs）及益心复脉颗粒+NRF-2/HO-1信号通路抑制剂ML385干预组（YXFMs+ML385）四组。除Control组外，余三组均以D-半乳糖预处理48小时诱导细胞衰老，YXFMs组予益心复脉颗粒干预处理，YXFMs+ML385予益心复脉颗粒+ML385干预处理。细胞分组及处理结束后，以β-半乳糖苷酶（β-galactosidase，β-GAL）染色、P16免疫荧光染色及细胞周期检测评估细胞衰老水平；以DCFH-DA荧光探针染色及Mito-tracker线粒体荧光探针染色评估细胞氧化应激水平；并以免疫荧光染色及Western-blot检测评估NRF-2/HO-1信号通路蛋白表达。 3.采用人源诱导多能干细胞诱导的心房肌细胞（Humaninducedpluripotentstemcell-derivedatrialmyocytes，hiPSC-AMs）模拟窦房结起搏细胞，将hiPSC-AMs细胞分为Control、D-galactose、YXFMs及YXFMs+ML385四组。对应处理结束后，以CardioExcyte96系统检测各组细胞搏动频率及场电位时程，评估细胞搏动功能。论文二 1.以免疫荧光染色检测Control、SND及YXFMs三组小鼠窦房结组织VSNL1、HCN4及CACNA1G蛋白表达水平，评估窦房结组织心肌化程度及起搏相关离子通道表达；并以Western-blot检测窦房结组织中SHOX2蛋白表达。 2.将HL-1细胞分为Control、D-galactose、YXFMs及YXFMs+ML385四组，对应处理结束后，以免疫荧光染色及Western-blot检测细胞SHOX2及PITX2蛋白表达。 3.将hiPSC-AMs细胞分为Control、阴性转染对照组（si-NC）、SHOX2基因敲减组（si-SHOX2）、si-SHOX2基因敲减+益心复脉颗粒干预组（YXFMs）、SHOX2基因敲减+BMP4激动剂SB4干预组（SB4）及SHOX2基因敲减+益心复脉颗粒组+BMP4抑制剂LDN193189组（YXFMs+LDN193189）六组。以LipofectamineRNAiMAX转染试剂完成si-SHOX2基因干扰序列转染，并进行药物干预；以CardioExcyte96系统检测各组细胞搏动频率及场电位时程，评估细胞搏动功能。 4.接下来，将HL-1细胞分为Control、si-NC、Shox2基因敲减组（si-Shox2）、Shox2基因敲减+益心复脉颗粒干预组（YXFMs）及Shox2基因敲减+BMP4激动剂SB4干预组（SB4）五组。以LipofectamineRNAiMAX转染试剂完成si-Shox2基因干扰序列转染，并进行药物干预；以RT-qPCR检测Shox2、Bmp4、Hcn4及Cacna1g基因表达；以免疫荧光染色检测细胞膜HCN4及CACNA1G蛋白表达；以Western-blot检测细胞SHOX2、BMP4、GATA4、NKX2-5蛋白表达。论文三 1.以BATMAN-TCM数据库获取益心复脉颗粒组方中药（生晒参Ginseng、丹参Salvia、麦冬Ophiopogon、黄芪Astragalus、五味子Schisandra、川芎Ligusticumwallichii）的活性成分及潜在作用靶点（Scorecutoff≥30、AdjustedPvaluecutoff＜0.05）； 2.以Uniprot数据库校正匹配靶点的基因名；将获取的药物活性成分及校正匹配后的潜在作用靶点导入Cytoscape3.8.0软件，构建益心复脉颗粒组方中药-活性成分-潜在靶点互作网络。 3.在益心复脉颗粒组方中药-活性成分-潜在靶点互作网络中选取NRF-2，构建益心复脉颗粒组方中药-活性成分-NRF-2互作网络；以cytoHubba插件计算活性成分与NRF-2相互作用的Degree值，从高至低取前三种活性成分进行分子对接。 4.从PubChem数据库中下载以上三种活性成分的结构式，以Chem3D14.0.0.17软件制作相应的3D结构，并输出为mol2格式；以PDB数据库下载核心蛋白结构域的pdb格式，并以PyMOL2.4.0软件对蛋白质进行去水、去磷酸根等操作；最后利用AutoDockTools1.5.6软件及DiscoveryStudio2019软件进行分子对接。结果：论文一 1.增龄性SND小鼠相较对照组小鼠心率显著降低，R-R间期延长，且窦房结组织纤维化水平及细胞凋亡率显著上升，氧化应激水平升高，ROS聚积并伴随NRF-2蛋白表达及激活减少；给予益心复脉颗粒处理后，YXFMs组小鼠相较SND组心率得到明显提升，R-R间期缩短，且窦房结组织纤维化水平及细胞凋亡率显著下降，氧化应激水平及ROS含量降低，窦房结组织NRF-2表达及激活增加。提示益心复脉颗粒可能通过促进增龄性SND小鼠窦房结NRF-2表达及激活抑制衰老诱导的窦房结氧化应激损伤及退行性改变，改善窦房结功能障碍。 2.D-半乳糖诱导衰老后，相较Control组，D-galactose组细胞β-GAL染色阳性率升高，伴随衰老相关P16蛋白高表达，且细胞周期停滞于G1/G0期；同时细胞ROS含量显著升高，线粒体活性下降，伴随NRF-2及HO-1蛋白表达及激活下降。给予益心复脉颗粒干预后，相较D-galactose组，YXFMs组细胞β-GAL染色阳性率及P16蛋白表达量降低，且细胞周期异常得到改善；同时ROS含量显著下降，线粒体活性增强，伴随NRF-2及HO-1蛋白表达及激活增加。但在给予益心复脉颗粒的同时给予NRF-2/HO-1信号通路抑制剂ML385后，YXFMs+ML385组细胞相较YXFMs组β-GAL染色阳性率及P16蛋白表达量显著升高，细胞周期异常，伴随ROS含量上升及线粒体活性下降，且NRF-2及HO-1蛋白表达及激活下降。提示益心复脉颗粒可通过激活NRF-2/HO-1信号通路改善细胞衰老及高氧化应激状态。 3.D-半乳糖诱导衰老后，hiPSC-AMs细胞搏动频率下降，场电位时程延长。给予益心复脉颗粒干预后，相较D-galactose组，YXFMs组hiPSC-AMs细胞搏动频率显著升高，场电位时程缩短。但在给予益心复脉颗粒的同时给予NRF-2/HO-1信号通路抑制剂ML385后，相较YXFMs组，YXFMs+ML385组细胞搏动频率显著下降，场电位时程延长。提示益心复脉颗粒可通过激活NRF-2/HO-1信号通路改善衰老诱导的hiPSC-AMs细胞搏动功能减退。论文二 1.免疫荧光染色及Western-blot检测结果显示增龄性SND小鼠窦房结组织VSNL1、HCN4、CACNA1G及SHOX2蛋白表达量相较Control组小鼠显著降低；给予益心复脉颗粒干预后，相较SND组，YXFMs组小鼠VSNL、HCN4、CACNA1G及SHOX2蛋白表达量显著升高。提示益心复脉颗粒可能通过促进增龄性SND小鼠窦房结组织SHOX2表达上调If通道及T型钙通道表达，改善窦房结起搏细胞心肌化，增强窦房结起搏功能。 2.D-半乳糖诱导衰老后，免疫荧光染色及Western-blot检测结果显示相较于Control组，D-galactose组细胞PITX2表达量显著升高，SHOX2表达量显著降低；给予益心复脉颗粒干预后，与D-galactose组相比，YXFMs组细胞PITX2表达量降低，SHOX2表达量升高；但在给予益心复脉颗粒的同时给予NRF-2/HO-1信号通路抑制剂ML385后，YXFMs+ML385组细胞相较YXFMs组细胞PITX2表达量升高，SHOX2表达量降低。提示益心复脉颗粒可通过激活NRF-2/HO-1信号通路改善衰老诱导的氧化应激，调控氧化应激依赖性PITX2进而促进SHOX2表达。 3.SHOX2基因敲减后，hiPSC-AMs细胞搏动频率下降，场电位时程延长；给予益心复脉颗粒或BMP4激动剂SB4干预后，与si-SHOX2组相比，YXFMs及SB4组hiPSC-AMs细胞搏动频率显著升高，场电位时程缩短；但在给予益心复脉颗粒的同时给予BMP4抑制剂LDN193189后，与YXFMs组相比，YXFMs+LDN193189组细胞搏动频率显著下降，场电位时程延长。提示益心复脉颗粒激活NRF-2/HO-1信号通路抑制氧化应激，调控PITX2进而促进SHOX2表达，而SHOX2通过激活下游BMP4发挥作用，改善hiPSC-AMs细胞搏动功能障碍。 4.RT-qPCR及免疫荧光染色结果发现，Shox2基因敲减后的HL-1细胞Shox2、Bmp4、Hcn4、Cacna1g基因表达量及细胞膜HCN4、CACNA1G蛋白表达量显著降低；给予益心复脉颗粒或BMP4激动剂SB4处理后，上述基因及蛋白表达得到显著恢复。Western-blot检测结果发现Shox2基因敲减后的HL-1细胞SHOX2、BMP4、GATA4蛋白表达量显著下降，NKX2-5表达量显著升高；给予益心复脉颗粒或BMP4激动剂SB4处理后，SHOX2、BMP4、GATA4蛋白表达量显著升高，NKX2-5蛋白表达量显著下降。提示益心复脉颗粒通过激活NRF-2/HO-1信号通路调控PITX2促进SHOX2表达，而SHOX2通过激活下游BMP4/GATA4/NKX2-5信号通路促进HCN4及CACNA1G表达，改善起搏相关离子通道表达，抑制窦房结起搏细胞心肌化，改善窦房结功能。论文三 1.经过BATMAN-TCM数据库检索并筛选后共获得益心复脉颗粒的组方中药活性成分282种，经预测、合并及去重后获得药物潜在靶点273个；采用Cytoscape3.8.0软件构建益心复脉颗粒组方中药-活性成分-潜在靶点互作网络,共包含562个节点，2116条边。 2.以Cytoscape3.8.0软件构建益心复脉颗粒组方中药-活性成分-NRF-2互作网络，共包含114个节点，234条边；cytoHubba插件计算活性成分与NRF-2相互作用的Degree值，从高至低排列前三的活性成分为尿苷（Uridine）、原儿茶酸-3-葡萄糖苷（ProtocatechuicAcid-3-Glucoside）及(Z,Z'')-二藁本内酯（(Z,Z’)-Diligustilide）。 3.取以上三种活性成分与核心蛋白NRF-2进行分子对接，结果显示三种活性成分均能与核心蛋白NRF-2形成半柔性对接，且(Z,Z’)-Diligustilide与核心蛋白NRF-2形成的对接模型最稳定。结论： 1.衰老导致窦房结组织NRF-2表达及激活异常，窦房结组织呈高氧化应激状态，ROS聚积引起窦房结组织损伤及退行性改变；同时，高氧化应激状态引起窦房结组织SHOX2表达受限，起搏相关离子通道（If通道及T型钙通道）功能障碍，导致增龄性SND，最终引起SSS。 2.益心复脉颗粒不仅可通过调控NRF-2/HO-1信号通路改善衰老诱导的窦房结高氧化应激状态，清除ROS产生窦房结组织保护作用；还可通过NRF-2/HO-1信号通路调控氧化应激依赖性PITX2促进SHOX2表达，进而激活下游BMP4/GATA4/NKX2-5信号通路上调If通道及T型钙通道表达，抑制窦房结起搏细胞心肌化，改善衰老诱导的增龄性SND。 3.NRF-2/HO-1信号通路是益心复脉颗粒改善衰老诱导窦房结组织损伤及起搏相关离子通道异常的核心信号通路，益心复脉颗粒组方中药活性成分Uridine、ProtocatechuicAcid-3-Glucoside及(Z,Z’)-Diligustilide均可与NRF-2形成稳定对接，且源于中药川芎的活性成分(Z,Z’)-Diligustilide与NRF-2对接最稳定。 4.本研究证实益心复脉颗粒不仅可提升增龄性SND小鼠心率，还可通过NRF-2/HO-1信号通路抑制氧化应激、改善窦房结退行性改变、促进起搏相关离子通道表达，为中药治疗SSS“上游调控”作用提供科学依据，为益心复脉颗粒“标本兼治”作用提供基础证据，为SSS的临床治疗提供更多选择。而NRF-2对接活性成分筛选则进一步阐明了益心复脉颗粒的作用机制，也为未来新药研发提供了依据与线索。

作者：

张恒

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关键词：

病态窦房结综合征增龄性窦房结功能减退益心复脉颗粒衰老 NRF-2/HO-1信号通路

授予学位：

博士

学科专业：

中西医结合临床

导师：

侯平

学位年度：

2023

学位授予单位：

辽宁中医药大学

语种：

中文

中图分类号：