摘要
目的：通过观察重症肺炎支原体肺炎（SMPP）小鼠血清和肺组织中SOD、MDA和ROS的水平变化，探究SMPP小鼠体内氧化应激的损伤情况；观察不同剂量的养阴清肺汤加味对ROS-Nrf2-ARE信号通路相关因子及SOD、MDA值的干预，探究SMPP的疗效机制。 材料与方法：将48只BALB/c小鼠随机分为正常组和模型组2组，模型组小鼠经麻醉后使用1×1010CCU/ml的MP菌液滴鼻构建SMPP模型，模型建立成功后，分别在第3、7、10、14天进行取材。观察小鼠的一般状况；采用紫外分光光度法检测小鼠血清和肺组织中SOD和MDA的含量。ELISA法检测小鼠血清和肺组织中ROS的含量。将36只BALB/c小鼠随机分为正常组、模型组、养阴低剂量组、养阴中剂量组、养阴高剂量和阿奇霉素组6组。除正常组外，其他组小鼠采用与实验一相同方法构建SMPP模型，建模成功后在干预后第7天对所有组进行取材。观察小鼠的一般状况；计算小鼠肺指数；采用紫外分光光度法检测小鼠血清中MDA和SOD的含量，ELISA法检测小鼠血清中ROS的含量。采用qPCR法对肺组织中的Keap1、Nrf2、HO-1的基因含量进行测定，Westernblot法检测小鼠肺组织中Keap1、Nrf2、HO-1的蛋白表达。 结果： 实验一： 1.小鼠一般状态观察：正常组小鼠一般状态良好，活跃度正常，毛发色泽鲜亮，呼吸均匀，鼻腔无异常分泌物，饮食和饮水均正常，排便正常。模型组小鼠从造模后第3天开始，部分小鼠精神疲倦，活跃度下降，体重减轻；造模后第7天，几乎所有小鼠精神状态萎靡，出现竖毛、厌食和饮水减少的状况。在造模第14天，小鼠的精神状况略微好转，但整体状况仍然不佳。 2.小鼠肺组织在光镜下的形态：正常组小鼠的肺组织形态结构正常，未出现炎性细胞浸润的状况。模型组小鼠肺组织结构明显损伤，难以见到完整肺泡，可以观察到肺泡间隔明显增宽，并有大量的炎性细胞渗出。小鼠的病理评分结果显示，模型组小鼠的病理评分在第7天时达到峰值，而后逐渐回落。 3.比较各组小鼠血清中SOD、MDA和ROS的水平：在MP感染后，与正常组相比，模型组血清SOD的总体水平下降，MDA和ROS的总体水平升高，峰值与谷值均在第7天出现；与正常组相比，模型组第7天和第10天血清中的SOD含量明显下降，MDA和ROS的含量明显升高，有统计学意义（P＜0.05）。比较各组小鼠肺组织中SOD、MDA和ROS的水平：与正常组相比，模型组整体肺组织SOD的含量更低，MDA和ROS的含量更高。与正常组比较，模型组第7天和第10天肺组织的SOD含量明显下降、MDA和ROS的含量明显升高，有统计学意义（P＜0.05）；与模型组第3天相比，模型组第7天和第10天肺组织的SOD水平下降，MDA和ROS水平上升，有显著差异，具有统计学意义（P＜0.05）；模型组第7天与模型组第14天比较，肺组织的SOD含量下降，MDA和ROS的含量升高，且具有统计学意义（P＜0.05）。模型组第10天与第14天比较，虽然第10天的SOD含量更低，MDA和ROS的含量更高，但无统计学意义。（P＞0.05） 实验二： 1.小鼠一般状态观察：正常组小鼠一般状态良好，精神和活跃度正常。其他组小鼠在造模后第3天开始，出现不同程度的变化，模型组小鼠状态最差。造模后第7天，模型组几乎所有小鼠精神状态欠佳，出现竖毛、厌食和饮水减少的状况。除正常组外，养阴高剂量组与阿奇霉素组小鼠的状态更好。在给药后第7天，各治疗组状态均有所改善，养阴高剂量组与阿奇霉素组小鼠改善更加明显。 2.小鼠肺组织在光镜下的形态：正常组小鼠的肺组织形态结构正常。模型组小鼠肺组织结构明显损伤，仅有个别完整肺泡，肺泡间隔出现明显增宽，可以观察到大量的炎性细胞渗出。养阴低剂量组可以观察到有部分炎性细胞浸润，肺泡间隔增宽，在细支气管附近可观察到较多淋巴细胞浸润。养阴中剂量组有部分的炎性浸润，肺泡间隔轻度增宽，在细支气管附近可以看到中等淋巴细胞浸润。养阴高剂量组有少量的炎性细胞浸润，肺组织形态结构轻度受损，整体优于其他两组剂量的养阴组。西药组支气管附近有一定的炎性细胞浸润，有轻度的肺组织形态结构损伤。 3.小鼠肺指数与病理评分：观察小鼠的肺指数，与正常组相比，其他组的肺指数均有上升，其中模型组最高，阿奇霉素组最低。与模型组相比，各个治疗组的肺指数均有下降，且具有统计学意义（P＜0.05）。与养阴低剂量组相比，养阴中剂量组、养阴高剂量组和阿奇霉素组肺指数降低，具有统计学意义（P＜0.05）。养阴中剂量组与养阴高剂量组和阿奇霉素组的肺指数相比亦有统计学意义（P＜0.05），但阿奇霉素组与养阴高剂量组的肺指数相比，无统计学意义（P＞0.05）。观察小鼠的病理评分,其中模型组病理评分最高，阿奇霉素组评分最低。与养阴低剂量组相比，养阴中剂量组、养阴高剂量组和阿奇霉素组病理评分更低，差异具有统计学意义（P＜0.05）。与养阴中剂量组相比，养阴高剂量组和阿奇霉素组的病理评分明显降低，有统计学意义（P＜0.05）。阿奇霉素组的病理评分略低于养阴高剂量组，但无统计学意义（P＞0.05）。 4.观察小鼠血清中ROS的含量：发现模型组小鼠血清中的ROS含量升高最多，与正常组比较其差异有统计学意义（P＜0.05），其余各治疗组与模型组相比，ROS的含量均有下降，具有统计学意义（P＜0.05）。与养阴低剂量组相比，养阴高剂量组和阿奇霉素组的ROS含量下降，具有统计学意义（P＜0.05）。养阴高剂量组的ROS含量略微低于阿奇霉素组，但无显著差异，不具有统计学意义（P＞0.05）。 5.采用紫外分光光度法检测小鼠血清中SOD和MDA的含量：与正常组相比，其他各组血清SOD的含量均降低，MDA的含量均升高。与模型组相比，各治疗组血清SOD的含量均升高，MDA的含量均下降。模型组和养阴中剂量组、阿奇霉素组SOD的含量相比有显著差异，有统计学意义（P＜0.05）。养阴高剂量组虽比模型组SOD的含量升高，但无统计学意义（P＞0.05）。与养阴高剂量组相比，阿奇霉素组SOD的含量显著升高，且有统计学意义（P＜0.05）。与养阴低剂量组相比，养阴中剂量组、养阴高剂量组和阿奇霉素组的MDA含量显著下降，具有统计学意义（P＜0.05）。养阴中剂量组与养阴高剂量组、阿奇霉素组的MDA相比，亦有统计学意义（P＜0.05）。阿奇霉素组的MDA含量虽略低于养阴高剂量组，但无统计学意义（P＞0.05）。 6.qPCR法检测肺组织中Keap1、Nrf2和HO-1的mRNA含量：检测肺组织中Keap1、Nrf2和HO-1的基因表达量，发现模型组基因表达水平最低。与正常组相比，其他组的Keap1、Nrf2和HO-1基因水平均显著增高，差异具有统计学意义（P＜0.05）。与模型组相比，各个治疗组Keap1、Nrf2和HO-1的基因水平显著增长且有统计学意义（P＜0.05）。与养阴低剂量组的Keap1、Nrf2基因水平相比，养阴中剂量组的基因水平更高，差异具有统计学意义（P＜0.05），但养阴低剂量组与养阴中剂量组的HO-1基因水平相比，差异不具有统计学意义（P＞0.05）。与低剂量组、中剂量组的Nrf2和HO-1基因水平相比，养阴高剂量组的水平显著增高，具有统计学意义（P＜0.05）。阿奇霉素组的Nrf2和HO-1基因水平最高，且与养阴高剂量组相比，差异具有统计学意义（P＜0.05）。7.WB测定肺组织中Keap1、Nrf2和HO-1的蛋白表达：在MP感染后，与正常组相比，其他各组肺组织中Keap1、Nrf2和HO-1的蛋白表达均下降。与模型组比较，各个治疗组的Keap1、Nrf2和HO-1蛋白表达均显著上升，差异具有统计学意义（P＜0.05）。与中剂量组、低剂量组相比，养阴高剂量组Keap1、Nrf2和HO-1蛋白表达的升高，有统计学意义（P＜0.05）。与养阴高剂量组相比，阿奇霉素组的Keap1、Nrf2和HO-1蛋白表达差异具有统计学意义（P＜0.05）。 结论： 1.SMPP可导致ROS和MDA的含量升高，SOD的含量降低，进一步证实了SMPP的发病机制与氧化损伤关系密切，通过其指标变化能够预测SMPP的发生并判断疾病的严重程度。 2.养阴清肺汤加味能够增加Keap1、Nrf2和HO-1的表达并减少ROS的含量，增加抗氧化指标SOD的含量，降低氧化指标MDA的含量，提示养阴清肺汤加味能够调节SMPP的氧化应激损伤，且存在剂量依赖关系，ROS-Nrf2-ARE信号通路可能是其作用机制之一。
NETL