摘要
研究背景 斑块型银屑病，即寻常型银屑病，发病机制复杂，目前治疗方式虽种类繁多，但是缺乏长期有效的方法。根据课题组前期研究成果发现:①初期横断面调查显示斑块型银屑病患者存在脂肪代谢异常;②银屑病患者血清代谢组学结果提示血清中存在鞘脂代谢失衡现象，其中神经酰胺(Ceramide,Cer)、鞘磷脂(sphingomyelin,SM)表达异常;③蛋白组学结果提示银屑病小鼠皮损中，与Cer、1-磷酸鞘氨醇(Sphingosine-1-phosphate,S1P)生成密切相关的蛋白酶SPTLC2、SPHK表达异常。结合文献调查提示，鞘脂代谢以Cer与S1P两种生物活性鞘脂为核心，两者可以相互转化，参与皮肤细胞多种代谢活动。Cer可以抑制角质形成细胞程序性凋亡，使之不能正常分化，从而过度增生;其次Cer是皮肤屏障重要的组成部分，具有良好的锁水能力。而S1P可参与NF-κB信号通路转导，影响淋巴细胞的迁移和分布。因此，斑块型银屑病与鞘脂代谢的失衡有着密切的联系。 研究目的 本研究首先利用银屑病小鼠模型为研究对象，明确开玄解毒除湿方对于斑块状银屑病的药效作用;其次利用靶向脂质组学的检测方法明确斑块状银屑病中鞘脂代谢异常现象，探讨开玄解毒除湿方对于具体鞘脂代谢产物的调节作用;结合网络药理学与分子对接的生物信息学分析手段预测开玄解毒除湿方参与调控鞘脂代谢相关蛋白靶点;最后利用银屑病小鼠模型、银屑病HaCat细胞模型为研究对象，鞘脂代谢产物S1P信号通路的功能拮抗剂作为对照，探讨开玄解毒除湿方及其活性成分调节斑块状银屑病鞘脂代谢的作用机制。 研究方法: 1.开玄解毒除湿方对咪喹莫特诱导的银屑病模型小鼠皮损的影响及安全性评价: 60只SPF级别雄性C57小鼠，随机均分为5组，分别为空白组、模型组、开玄解毒中剂量组、开玄解毒高剂量组以及FTY720组。除空白组外，其余组均采用外涂62.5mg咪喹莫特的方法建立银屑病小鼠模型，干预5天，在第6天进行脾脏、皮肤、胸腺、血清取材。记录小鼠每日体重、每日皮损图像采集，进行PASI评分;行胸腺和脾脏指数测量;拍摄真皮毛细血管增生情况。综合以上结果评估开玄解毒除湿方对于银屑病小鼠皮损症状、体征的改善情况及安全性，同时筛选疗效良好的中药浓度。随后采用HE染色测量表皮厚度、免疫组化法检测皮损中PCNA含量评估表皮增生情况;WB法检测皮损中Claudin-1、Occludin蛋白含量评估皮肤屏障功能;WB法检测NF-κB信号通路蛋白含量评估炎症信号通路;WB法检测皮损及脾脏脏中CD3表达评估淋巴细胞迁移及分布情况;Elisa法检测IL-23、IL-17含量评估疾病炎症程度;同时行肝、肾组织HE染色，Elisa法检测血清中肝肾生化指标ALT、AST、BUN含量评估开玄解毒除湿方的药物安全性。 2.靶向脂质组学检测开玄解毒除湿方对咪喹莫特诱导的银屑病模型小鼠皮损中鞘脂代谢产物含量 收集实验一中健康组、银屑病模型组、开玄解毒除湿方高剂量干预组小鼠的皮损组织各10例，采取液谱质谱联用的方式，靶向检测分析皮损中的鞘脂代谢产物含量，包括Cer、S1P、Sph、SM、GluCer、LacCer、GalCer。 3.基于网络药理学与分子对接预测开玄解毒除湿方治疗斑块型银屑病的潜在靶点 首先利用TCMSP和TCMIP中药在线数据库，筛选中药活性成分获取作用靶点;然后利用5个疾病数据库（GeneCards、OMIM、TTD、DisGeNET、DrugBank）建立斑块型银屑病作用靶点，获得药物与疾病的交叉靶点。利用获得的交集靶点，建立蛋白互作图、进行基因功能分析与通路富集分析。同时构建“药物成分-靶点-通络”网络图，根据拓扑参数选择排名前三的核心活性成分。最后利用分子对接技术进行核心成分与靶标蛋白的对接。 4.开玄解毒除湿方参与咪喹莫特诱导的银屑病模型小鼠皮损中鞘脂代谢的调节 选择实验一中健康组、模型组、开玄解毒除湿方高剂量组、FTY720组的皮损组织。免疫组化法检测皮损组织中S1P的含量;免疫荧光法检测皮损中Cer的含量;WB法检测与Cer、S1P生成相关的蛋白酶SPHK、SPTLC2、ASAH1的含量;q-PCR法检测五种S1P受体的mRNA水平，综合评估开玄解毒除湿方对于鞘脂代谢的具体调节机制。 5.开玄解毒除湿方参与银屑病HaCat细胞模型中鞘脂代谢的调节 通过联合使用3种炎症因子（IL-17、IL-22、TNF-a,1∶1∶1,各40ng/ml）干预HaCat细胞48h的方法建立银屑病细胞模型。同时制备大鼠含药血清，使用MTT法确定含药血清干预浓度、筛选山奈酚及FTY720干预模型的浓度。随后采用WB法检测胞间连接蛋白、NF-κB信号通路蛋白，流式法检测细胞周期、q-PCR法检测炎症因子评估开玄解毒除湿方对于HaCat细胞模型的改善作用。 最后通过免疫荧光法检测S1P、Cer含量、WB法检测鞘脂代谢相关蛋白SPHK、SPTLC2、ASAH1的含量、q-PCR法检测S1P受体的mRNA表达水平评估开玄解毒除湿方对鞘脂代谢的调节机制。 研究结论: 1.开玄解毒除湿方能够显著改善银屑病模型小鼠局部皮损，包括修复皮肤屏障、抑制表皮增生、抑制NF-κB炎症信号通路、降低炎症因子、影响淋巴细胞分布。 2.开玄解毒方安全性良好。 3.斑块状银屑病中存在鞘脂代谢失衡现象，开玄解毒除湿方对于多种鞘脂代谢产物具有调节作用。 4.开玄解毒除湿方能够通过干预相关鞘脂代谢产物水平（Cer、S1P）参与鞘脂代谢相关过程的调节。 5.开玄解毒除湿方改善斑块状银屑病皮损的潜在机制可能与调节鞘脂代谢相关过程有关。
NETL