摘要
目的： 胎膜早破（Pretermprematureruptureofmembranes,PROM）是指分娩前胎膜的过早破裂。PROM导致新生儿发生呼吸窘迫综合征、新生儿败血症、母体绒毛膜羊膜炎、感染性子宫内膜炎、胎盘早剥等，严重损害孕产妇及新生儿的健康。目前针对PROM尚无有效的早期检测方法、预防和治疗手段，促进胎膜组织愈合是预防PROM的研究热点。其中羊膜组织是胎膜的主要承重结构，羊膜创伤愈合机制涉及不同的动态过程，从炎症（包括组织清创和细胞黏附的动态变化）开始，然后是再上皮化（包括细胞迁移和增殖），最后是整体组织重塑。近年来研究表明，阴道微生物群及其代谢产物在PROM中可能起着关键作用，但其在胎膜愈合中作用尚未研究。本研究旨在明确阴道微生物群代谢产物在PROM患者胎膜愈合中的作用，探索PROM治疗的潜在靶点。 方法： 1.建立前瞻性研究队列，运用非靶向代谢组学检测PROM组（10例）和正常组（HC组）（10例）之间的小分子代谢产物，筛选出差异性代谢产物。 2.利用肿瘤坏死因子-α（tumornecrosis-α,TNF-α）对WISH细胞（人羊膜上皮细胞）进行刺激构建体外炎症模型，加入差异性代谢产物，通过酶联免疫吸附试验（enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA）实验分析差异性代谢产物对体外炎症模型的影响，检测细胞上清中半乳糖凝集素的含量。 3.利用脂多糖（lipoplysaccharide,LPS）对WISH细胞进行刺激构建氧化应激模型，加入差异性代谢产物，通过活性氧（reactiveoxygenspecies,ROS）荧光探针实验分析差异性代谢产物对体外氧化应激模型的影响。 4.消化法原代培养羊膜上皮细胞（humanamnioticepithelialcells,hAECs），运用免疫荧光（immunofluorescence,IF）鉴定羊膜上皮细胞。运用划痕、transwell迁移、细胞活力检测（cholecystokininoctapeptide,CCK-8）、蛋白印迹（western-blot,WB）、ELISA等实验分析研究差异性代谢产物对hAECs和WISH细胞的迁移、增殖、上皮间充质转化（epithelial-mesenchymaltransition,EMT）以及蛋白激酶B（ProteinkinaseB,Akt）通路的影响。 5.通过二甲基亚甲蓝（dimethylmethyleneblue,DMMB）比色法和ELISA检测加入差异性代谢产物后糖胺聚糖（glycosaminoglycan,GAG）和透明质酸（hyaluronicacid,HA）的含量，验证D-GalNAc对细胞外基质的影响即对羊膜伤口愈合中组织重塑的影响。 结果： 1.对20名受试者阴道分泌物进行非靶向代谢组学检测，研究发现N-乙酰-d-半乳糖胺（N-acetyl-d-galactosamine,D-GalNAc）在PROM组中显著低于HC组（P=0.0025）。 2.D-GalNAc预处理降低TNF-α刺激的WISH细胞白介素-6（interleukin6,IL-6）的表达（P＜0.05）；D-GalNAc预处理降低TNF-α刺激的WISH细胞ROS的表达（P＜0.05）；D-GalNAc促进半乳糖凝集素-1（galectin-1,gal-1）、半乳糖凝集素-3（galectin-3,gal-3）的表达起到抗炎和抗氧化应激的作用（P＜0.05）。 3.D-GalNAc显著促进hAEC（50%vs.80%）和WISH细胞的迁移，通过Akt信号通路部分EMT达到促进胎膜愈合（P＜0.05）；D-GalNAc对hAEC和WISH细胞的活性无影响（P＞0.05）。 4.D-GalNAc上调WISH细胞中糖胺聚糖的表达（P＜0.05），但对透明质酸水平没有影响（P＞0.05）。 结论： 通过非靶向代谢组学分析得知多条代谢信号通路参与了阴道微生态失调可能导致PROM的发生，小分子差异性代谢产物主要有D-GalNAc，推测D-GalNAc对胎膜组织具有保护效能，对PROM具有防治作用。D-GalNAc促进gal-1、gal-3的表达抑制细胞中IL-6和ROS的产生，表明D-GalNAc可以通过抗炎和抗氧化应激的作用，在羊膜组织愈合的炎症阶段发挥作用。D-GalNAc能够激活Akt信号通路加速EMT促进细胞迁移和GAG生成，在羊膜伤口愈合的EMT、迁移阶段和重塑阶段发挥作用。D-GalNAc在羊膜伤口愈合的各个阶段发挥作用，具有促进胎膜早破患者羊膜组织愈合的潜能，有较好的实际应用意义。
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