摘要
肺癌作为国内发病率及病死率最高的恶性肿瘤，严重威胁着人们的生命健康。根据病理类型，肺癌主要分为小细胞肺癌（SCLC）以及非小细胞肺癌（NSCLC）,其中肺腺癌（LUAD）作为NSCLC中占比最高（40％）的病理类型，发病率逐年上升。近年来，随着临床检验技术的发展以及治疗手段的进步，早期LUAD患者的5年生存率达到了 90％以上。但是由于中晚期LUAD通常具有局部浸润和远处转移的特点，其预后往往不佳。因此深入研究LUAD浸润、迁移相关的分子机制对于改善LUAD患者的预后至关重要。 长链非编码RNA（LncRNA）是一种长度大于200个核苷酸的非编码RNA。LncRNA在细胞中可以通过与RNA结合蛋白（RBP）相互作用参与细胞生理或者病理活动，其主要功能包括:染色质重塑、吸附作用、参与蛋白复合体的形成、转录激活、转录抑制、翻译抑制、剪切调控、mRNA翻译后降解等。近年来多项研究表明，LncRNA在肿瘤的发生发展中起着重要的作用，但是LncRNA参与LUAD发生发展的分子机制尚不明确,因此需要进一步探索。 目的: 1、筛选在LUAD发生发展中发挥关键作用的LncRNA,并进行验证。 2、探索MYO16-AS1在LUAD浸润及迁移中的作用及分子机制。 方法: 1、通过对临床收集的7组LUAD患者组织样本进行RNA-seq测序，对比GTEx数据库以及TCGA数据库中的数据，并且检测LUAD细胞与支气管正常细胞中MY016-AS1的表达水平，筛选出LUAD组织中低表达的LncRNA MYO16-AS1。 2、构建MYO16-AS1过表达和敲低细胞系，通过Transwell实验检测MYO16-AS1对LUAD迁移及侵袭能力的影响。通过裸鼠皮下移植瘤实验体内证明MYO16-AS1过表达对LUAD细胞增殖能力的影响。 3、通过RNA pulldown后蛋白质谱分析，对比公共数据库筛选出潜在的与MYO16-AS1结合的RBP。通过RNA pulldown以及RIP实验验证 MYO16-AS1与IGF2BP3的结合关系。通过荧光原位杂交（FISH）、免疫荧光实验检测MYO16-AS1与IGF2BP3的细胞内共定位情况。 4、通过IGF2BP3 iCLIP结果与RNA-seq数据中相关下调基因的交集分析下游靶基因。通过 Western blot、RT-qPCR 实验检测 MYO16-AS1/IGF2BP3 复合体对 HK2 表达水平的影响，通过葡萄糖含量测定实验检测过表达HK2对细胞内葡萄糖含量的影响。 5、通过Starbase数据库预测IGF2BP3和HK2 mRNA之间的关系，通过HDock数据库预测MYO16-AS1/IGF2BP3和IGF2BP3/HK2mRNA的空间结构关系。 结果: 1、MYO16-AS1在LUAD组织和细胞系中表达明显下调。 2、在体外实验中，过表达MYO16-AS1可显著抑制LUAD细胞侵袭及迁移能力。在体内实验中，过表达MYO16-AS1可显著抑制LUAD成瘤能力。 3、MYO16-AS1在胞质中与IGF2BP3直接结合。 4、MYO16-AS1/IGF2BP3复合体使得HK2 mRNA稳定性降低，抑制细胞糖代谢,进而抑制LUAD的侵袭、迁移能力。 5、MYO16-AS1与HK2 mRNA 竞争性结合 IGF2BP3。 结论: 1、MYO16-AS1在LUAD组织中的表达显著下调。 2、体外实验发现过表达的MYO16-AS1抑制了 LUAD细胞的侵袭、迁移;体内实验发现过表达MYO16-AS1抑制了 LUAD的成瘤能力。 3、在细胞质中，MYO16-AS1与IGF2BP3形成复合体，降低了 IGF2BP3与HK2 mRNA的结合效率，抑制IGF2BP3稳定HK2 mRNA的作用，进而导致HK2蛋白的表达水平降低，抑制LUAD侵袭和迁移的能力。
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