摘要
目的： 本研究通过建立我国Chinese1优势基因型获得性弓形虫眼病小鼠模型，探讨整合素淋巴细胞功能相关抗原（LFA-1）和细胞间粘附分子-1（ICAM-1）介导NK细胞杀伤作用与弓形虫眼部感染的关系以及对视网膜组织炎症的影响，为弓形虫眼病（oculartoxoplasmosis,OT）的发病机制及靶向治疗新方法提供重要线索。 方法： （1）C57BL/6小鼠经口感染20个TgCtWh6虫株包囊，建立我国Chinese1优势基因型获得性OT小鼠模型。苏木精和伊红（Hamp;E）染色观察眼部病理变化并采用PCR扩增眼组织中的弓形虫ITS-1基因；采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）和免疫组化方法分析眼组织中的干扰素-γ（IFN-γ）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白介素-10（IL-10）等细胞因子的表达水平变化；对眼组织转录组测序，进行基因表达差异分析、GO（geneontology）富集分析和KEGG（KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes）富集分析；通过流式细胞术检测眼组织中NK细胞和CD49a+NK细胞亚群百分比的变化、其表面受体LFA-1及配体ICAM-1的改变；通过qRT-PCR对眼组织中LFA-1/ICAM-1水平变化进行检测，并采用WB方法加以验证；（2）从第0天开始，用1%lifitegrast（LFA-1/ICAM-1抑制剂）治疗的感染小鼠记为“Lifitegrast1”组，或从第14天（疾病发作）开始治疗的记为“Lifitegrast2”组。连续每日三次滴眼（5μl/眼），直至第30天。流式细胞术观察局部滴用lifitegrast后眼组织中NK细胞和CD49a+NK细胞亚群百分比的变化及LFA-1/ICAM-1的表达情况，并采用WB方法加以验证；Hamp;E染色观察局部滴用lifitegrast对眼组织病理的改善情况；免疫组化和WB分析局部滴用lifitegrast后对细胞因子分泌的影响以及促凋亡蛋白caspase-3的改变。 结果： （1）成功建立OT小鼠模型后，Hamp;E染色结果显示感染组小鼠视网膜发生严重的病理改变，PCR扩增眼组织中弓形虫特异性基因ITS-1阳性，感染后眼组织中IFN-γ、TNF-α（P＜0.05）和IL-10（P＜0.01）表达上调。转录组测序结果显示，感染组小鼠眼组织中601个基因表达上调，108个基因表达下调，GO富集分析中差异表达基因在免疫反应、炎症反应等生物过程显著富集,KEGG富集分析显示31个差异表达基因富集在NK细胞介导的细胞毒性通路。受感染的小鼠眼组织中NK细胞的百分比显著增加（P＜0.01），而感染后脾脏中NK细胞的百分比显著降低（P＜0.05）。CD49a+NK细胞亚群在眼和脾脏中的百分比在感染后均显著增加（P＜0.01）。NK及CD49a+NK细胞亚群中的LFA-1（P＜0.05）和眼组织中的ICAM-1（P＜0.05）表达上调。（2）流式细胞术结果显示lifitegrast并未降低眼组织和脾脏中NK细胞和Lifitegrast2组（从第14天开始）中的CD49a+NK细胞亚群的百分比，但在Lifitegrast1组（从0天开始）中，眼组织（P＜0.01）和脾脏中（P＜0.05）的CD49a+NK细胞亚群的百分比显著降低。Lifitegrast可抑制眼组织中ICAM-1（P＜0.05）、LFA-1（P＜0.05）的蛋白表达以及Lifitegrast1组眼组织（P＜0.01）和脾脏（P＜0.05）NK和CD49a+NK细胞亚群细胞中LFA-1的表达。Liftegrast治疗改善了小鼠OT的病理状况，并显著抑制促炎细胞因子IFN-γ、TNF-α和促凋亡蛋白caspase-3的分泌。 结论： 成功建立了Chinese1优势基因型获得性OT小鼠模型，弓形虫感染后，眼组织中促炎细胞因子的表达升高，眼组织和脾脏中CD49a+NK细胞百分比增加以及LFA-1/ICAM-1表达上调，促进了OT的炎症反应并加重了眼组织病理损害。此外，lifitegrast治疗可改善OT的病理变化并减轻视网膜炎症反应，LFA-1和ICAM-1之间的相互作用在OT小鼠模型中CD49a+NK细胞亚群比例的早期调节中起作用。LFA-1/ICAM-1可能是OT发病机制中的关键分子，并可能为潜在的免疫治疗提供新见解。
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