摘要
甘油二酯(Diacylglycerol,DAG)是一种公认安全的健康功能性油脂,目前已被广泛应用于食品及医药等领域。在DAG的酶促合成过程中，引入有机溶剂或离子液体是一种通过调控酶促反应平衡和酶底物特异性来选择性富集单一产物的重要手段。而天然低共熔溶剂(Natural deep eutectic solvents,NADESs)是一种完全由生物体内小分子代谢物组成的新型绿色溶剂体系，研究表明其不仅是脂肪酶的良好保护剂，且适用于多种酶促反应。而目前NADESs在酶促油脂改性领域中主要应用于生物柴油、糖脂及环氧油脂等的制备，有关DAG制备的研究较少，且关于溶剂体系如何调控选择性合成结构酯的分子机制并未明晰。基于此，本研究制备了氯化胆碱基和甜菜碱基NADESs,对其形成机制及理化特性进行了表征分析;随后将其引入酶促酯化反应中，建立了一种绿色、高效的酶促酯化合成DAG的催化体系，并从酯化过程中水分活度和反应界面变化情况及酶解热力学三个角度对NADESs中促进DAG积累的原因进行了初探;最后结合实验研究和分子动力学模拟对NADESs中酶促选择性合成1,3-DAG的分子机制进行了研究。研究结果为理性调控酶促反应过程中反应产物的组成奠定了理论基础。具体研究内容与结果如下: (1)本研究制备了十种不同类别的氯化胆碱基和甜菜碱基NADESs,首先借助傅里叶红外和核磁对其结构进行表征分析，随后详细探究了两类NADESs的理化特性及水分含量、温度对部分溶剂特性的影响。研究表明NADESs主要通过组分间的氢键相互作用形成，分子间的氢键强弱与氢键供体的类别相关;甜菜碱基NADESs的粘度均高于氯化胆碱基，电导率显著低于氯化胆碱基，水分含量及温度对两类NADESs的粘度和电导率具有显著影响，且溶剂粘度及电导率随温度的变化均呈良好的线性变化，符合阿伦尼乌斯方程;NADESs的极性、酸碱性和密度与其氢键供体的类别相关，且溶剂极性随水分含量升高而增大;NADESs的水分活度介于0.081～0.232之间，均处于低水分活度状态，当水分含量增至50％则会破坏NADESs的氢键网络。 (2)本研究选用三种固定化脂肪酶分别在(1)中所制备的十种NADESs中进行酶促酯化反应合成DAG,并以无溶剂体系作为对照。经筛选分析确定最优固定化脂肪酶为Novozym 435,最优反应溶剂为ChCl∶Gly体系，且研究发现与无溶剂体系相比，在ChCl∶Gly体系下酶法酯化合成DAG和1,3-DAG的产量均大幅提升，副产物甘油单酯产量显著降低;由此建立了一种绿色、高效且有效降低副产物含量的酶法酯化制备DAG的催化体系;随后通过单因素及响应面实验对脂肪酶Novozym 435在ChCl∶Gly体系中催化酯化反应合成DAG的工艺进行研究。确定最优酯化反应条件:底物摩尔比为3.79,反应温度为51℃,加酶量为4.87％,反应时间为7.2 h,优化条件下DAG的实际产率达68.18％;最后从酯化过程中水分活度和反应界面的变化情况及酶解热力学初步探明了 ChCl∶Gly体系中可显著提高DAG含量的原因。 (3)本研究发现，相较于无溶剂体系，糖醇类NADESs在酶促酯化过程中可有效提高1,3-DAG的选择性，随后分别从NADESs对1,3-DAG的酰基转移和脂肪酶位置特异性的影响两个方面对其分子机制进行探究。结果表明NADESs的溶剂特性并非影响1,3-DAG酰基转移的主要因素，其主要通过调控酯化反应过程中的水分活度从而调控反应平衡，促进1,3-DAG的合成;通过探究NADESs对酶结构的影响不能直接反映对其位置特异性的影响，但结合圆二色谱、荧光光谱和分子动力学模拟的结果可知，NADESs可维系脂肪酶CALB的总体构象和二级结构的稳定性，NADESs与CALB间通过氢键相互作用维系三级结构的稳定性;最后通过分子动力学模拟获得CALB在无溶剂和NADESs体系中模拟催化底物甘油和油酸结合的自由能形貌图可知，NADESs体系中甘油sn-1,3位羟基与油酸反应的概率高于sn-2位羟基，NADESs有效提高了 CALB的sn-1,3位置特异性。综上，本研究认为NADESs主要通过同步调控酯化反应体系的水分活度和脂肪酶的sn-1,3位置特异性提高了 1,3-DAG的选择性。
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