摘要
研究背景及目的： 子痫前期(preeclampsia,PE)是指妊娠20周之后新发的以血压升高和终末器官功能障碍伴或不伴蛋白尿为特点的妊娠期特有疾病。其发病由胎盘、胎儿、母体等多种因素引起，但这些因素究竟如何相互作用从而导致子痫前期的发生，目前依旧未找到一个清晰而准确的答案。有研究表明，子痫前期患者胎盘产生的新陈代谢物质引起母体中性粒细胞聚集并活化，加剧炎症反应，损伤内皮细胞，导致胎盘血管重塑障碍，同时影响滋养层细胞侵袭与迁移能力，最终导致子痫前期的发生。因此，探讨中性粒细胞产生过度炎症反应对滋养层细胞功能的影响是揭示子痫前期发病因素中非常重要的环节。 近年来，一种高效的中性粒细胞发挥作用的形式—中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophil extracellular traps,NETs)受到研究者关注，这种方式不同于吞噬和脱颗粒等传统形式，而是通过形成一种高浓度的独特抗菌网状物质诱捕并且清除病原体。当病理性NETs大量生成时，可能通过诱导过度炎症反应直接损伤细胞和组织。高迁移率族蛋白B1(high-mobility group box 1，HMGB1)作为一种重要的损伤相关性分子，通过与细胞表面受体结合，参与晚期炎症反应。HMGB1作为NETs中的组成成分在疾病发生中起到重要的作用，在急性肺损伤、肿瘤、系统性红斑狼疮等疾病中得到了验证，但在子痫前期中是否产生影响，还需要进一步的深入研究。 综上所述，我们提出假说，NETs可能通过释放HMGB1造成滋养层细胞的损害,进而促进胎盘炎症因子的释放，造成胎盘功能障碍，导致子痫前期发生与发展。 研究方法： 1.样本收集:收集20例子痫前期患者和20例正常妊娠孕妇的血清和胎盘，通过ELISA法检测血清中NETs的特异性标志物髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)及弹性蛋白酶(neutrophil elastase,NE)浓度，并使用 Quant-iTTM PicoGreen dsDNA 试剂盒测定NETs的浓度;通过qRT-PCR及western blot检测两组胎盘之间HMGB1的表达差异;免疫荧光共定位法验证胎盘中HMGB1来源于NETs。 2.提取人中性粒细胞并刺激产生NETs:通过密度梯度离心法提取人中性粒细胞。流式细胞仪检测CD15b表达和Giemsa染色鉴定细胞纯度;使用佛波酯体外诱导释放NETs,测定其浓度。 3.探究NETs对人绒毛膜滋养层细胞HTR-8/SVneo的影响:通过划痕实验、Transwell迁移及侵袭实验检测NETs对HTR-8/SVneo细胞侵袭及迁移能力的影响;使用流式细胞凋亡技术检测细胞凋亡水平;使用ROS试剂盒对细胞释放ROS水平的变化进行测定。 4.探索NETs是否通过释放HMGB1影响人绒毛膜滋养层细胞HTR-8/SVneo:使用NETs组、NETs+甘草酸（HMGB1抑制剂）组以及对照组分别处理HTR-8/SVneo细胞,检测各组间HTR-8/SVneo细胞生物学功能变化;通过qRT-PCR及western blot测定加入各组刺激物后HTR-8/SVneo细胞中HMGB1及炎症因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α表达水平。 研究结果： 1.子痫前期患者血清中分NETs标志物释放较正常妊娠孕妇显著增加。 2.与正常妊娠孕妇组相比，子痫前期组患者胎盘中HMGB1表达明显增加，通过组织免疫荧光法验证在胎盘中MPO-HMGB1呈共定位表现，即证实HMGB1有可能来源于 NETs。 3.在NETs刺激下，HTR-8/Svneo细胞的凋亡率增加，细胞的侵袭和迁移能力降低,同时ROS的释放也增加。4.加入HMGB1抑制剂发现NETs通过释放HMGB1影响HTR-8/SVneo细胞生物学功能，并且促进HTR-8/SVneo细胞中炎症因子的表达。 研究结论： 本论文观察到子痫前期患者体内NETs及HMGB1的表达水平较正常妊娠孕妇明显增加，通过细胞实验证明了 NETs可以影响HTR-8/SVneo细胞生物学功能。通过加入甘草酸后证明NETs可通过释放HMGB1抑制HTR-8/SVneo细胞侵袭、迁移并增加细胞凋亡及ROS的释放，同时发现其炎症因子表达升高，加剧炎症反应，参与子痫前期的发生与发展。
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