摘要
2''-岩藻糖基乳糖（2''-Fucosyllactose,2''-FL）是人乳低聚糖中的主要成分之一，约占人乳低聚糖的30％,在预防婴幼儿传染病方面发挥着重要作用。2''-FL因具有抑制有害微生物生长的作用，使得其可作为益生元应用于婴幼儿配方奶粉中，而如何实现2''-FL的产业化生产是目前的研究热点。2''-FL的合成主要依赖全细胞发酵法，目前全细胞发酵法合成2''-FL主要是通过质粒的形式表达相关酶基因进而合成2''-FL,但工业化过程对菌株和生产稳定性提出更高要求促使对基因组水平的研究。本研究以大肠杆菌BL21（DE3）作为出发菌株，通过在该菌株基因组中构建2''-FL生产代谢途径，摇瓶发酵探究工程菌株发酵条件，并对2''-FL合成底物转运途径、GDP-L-岩藻糖合成路径及关键酶基因进行表达量优化，提高菌株生产2''-FL的能力。主要研究内容: （1）基因组水平2''-FL合成路径构建:首先通过CRISPR-Cas9基因编辑技术敲除大肠杆菌EscherichiacoliBL21（DE3）基因组中2''-FL合成前体物质相关代谢基因:β-半乳糖苷酶基因（lacZ）、UDP-葡萄糖脂质载体转移酶基因（wcaJ）和GDP-甘露糖甘露糖基水解酶基因（nudD），构建2''-FL合成底盘细胞。其次在此基础上将外源α-1,2-岩藻糖基转移酶基因（wbgL）和磷酸甘露糖转化酶基因（manB）、甘露糖-1-磷酸鸟苷转移酶基因（manC）、GDP-D-甘露糖-4，6-脱水酶基因(gmd)和GDP-岩藻糖合酶基因（wcaG）引入到大肠杆菌基因组中，2''-FL在所构建菌株B-05的摇瓶含量达到了1.99g/L。 （2）摇瓶发酵条件优化:通过单因素实验对菌株进行摇瓶发酵条件探究，优化后的发酵条件为:IPTG诱导浓度为0.4mmol/L、诱导时OD600为2.4,诱导温度为28℃。在此条件下，摇瓶中2''-FL合成量达到了3.92g/L,比未优化前提高了96.98％。 （3）乳糖转运途径改造:利用Ptac或PT7启动子替换乳糖操纵子Plac启动子，或者基因组水平过表达T7-lacY的形式调节乳糖运输进胞内的速率，证明了乳糖转运途径的调节有利于2''-FL的合成。在基因组水平表达的T7-lacY的情况下，2''-FL的产量达到了4.57g/L,比菌株B-05提高了14.54％。 （4）2''-FL合成关键酶表达量组合优化:将GDP-L-岩藻糖合成路径及α-1,2-岩藻糖基转移酶分为两个部分，通过组合优化的方式优化2''-FL的产量，证实了GDP-L-岩藻糖的供应量能促进2''-FL的生成。最优的拷贝数组合为单拷贝T7-wbgL、三拷贝T7-CBGW,该组合的工程菌株B-12在摇瓶水平48h产量高达7.86g/L。 (5)高密度分批补料发酵:为了进一步提高2''-FL的产量，本研究以分批补料的形式进一步验证2''-FL生产菌株的生产性能。在5L发酵罐中，经过90h的发酵，最终2''-FL的产量达到了120.26g/L,是目前文献报道最高水平。 本研究以构建基因组整合菌株为目标，获得一株具有产业化应用潜力的工程菌株,为规模化制备2''-FL奠定基础。
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