摘要
研究背景： 水态过度营养化是造成蓝藻水化的重要因素，微囊藻毒素（MCLR）是最其中毒性最强的一种，它对人类的身体造成了很大的伤害，因而受到了人们的普遍关注。MCLR可对人体神经、生殖、肝脏、肾脏等系统产生毒性，通过日常饮用水、水产品以及农作物等方式进入体内，逐渐对人体健康造成严重的影响。微塑料也是目前水体中的污染物之一，对生殖、淋巴、生殖等系统产生损害，从微塑料进入身体到产生毒性作用需要很长时间。我们前期已经证实MCLR会造成斑马鱼生殖腺活性氧的大量生成，破坏抗氧化酶系统，引起生长发育异常，而且还通过一系列实验后发现了斑马鱼亲代暴露后ROS大量生成引起氧化应激激活，最终造成子代的心率下降，MCLR和PS-MPs(微塑料)、PS-NPs(纳米塑料)如何引起斑马鱼组蛋白修饰最终造成子代心脏发育异常的机制目前尚不清晰。 目的： 本实验研究了亲代微囊藻毒素和微塑料、纳米塑料暴露引起氧化应激活化导致后代组蛋白甲基化，从而阻断WNT信号途径的传导，最终导致子代的心脏发育及表观遗传机制发生改变。本研究不仅有助于揭示微囊藻毒素和微塑料共暴露导致的心脏毒性及对子代心脏发育异常的机制，还有望从水体污染物共暴露角度为研究环境水体污染物的发育毒性开拓新的研究思路。 方法： 1.本实验采用Tg(myl7:EGFP)和成年AB系斑马鱼将其随机均分为代不同剂量微囊藻毒素（5、25μg/LMCLR）、微塑料与纳米塑料（5μm-1000μg/LPS-MPs、80nm-1000μg/LPS-NPs）、共暴露（0、5、5+5、5+80、25、25+5、25+80μg/L）和对照组。暴露时间为45天，45天后将雌雄单独分开，再交配产卵，产生F1代。 2.计算F1代2、4、7天时的心率；F1代胚胎3天孵化率，7天存活率；4、7天的体长和体重；1到7天的形态学检测。 3.测量3、5、7dpf的心包水肿情况和SV-BA距离 4.活性氧检测试剂盒检测3、5、7dpf幼鱼胚胎氧化应激水平。 5.抗氧化酶测定，检测4、7dpfMDA、SOD、GSH的水平。 6.AO细胞凋亡，检测3、5、7dpf斑马鱼幼鱼心脏区域细胞凋亡的水平。 7.HE染色法，检测4、7dpf斑马鱼幼鱼心脏区域组织病理学情况。 8.RT-PCR法检测测量4、7天F1代幼鱼WNT通路心脏基因（β-catenin、fzd、wnt11），心脏发育相关基因（nkx2.5、tbx5、gata4），H3K27me3去甲基酶（kam6a、kam6b），UTX靶基因（hoxd8、9、10、11）。 9.亲代共暴露后采用染色质免疫共沉淀（ChromatinImmunoprecipitation，CHIP)-qPCR法测定4天UTX启动子区域组蛋白修饰水平。 结果： 1.亲代微囊藻毒素和纳米塑料、微塑料暴露对子代生长发育的影响。 （1）微囊藻毒素(5、25μg/LMCLR)和微塑料、纳米塑料（5μm-1000μg/LPS-MPs、80nm-1000μg/LPS-NPs）共暴露影响子代生长发育：在2、4、7dpf时，共暴露5μg/LMCLR+5μm、5μg/LMCLR+80nm、25μg/LMCLR+80nm组与单暴露组5μg/LMCLR、25μg/LMCLR组相比心率显著下降（Plt;0.05）。 （2）共暴露5μg/LMCLR+5μm、25μg/LMCLR+5μm与单暴露5μmPS-MPs、5μg/LMCLR组相比，4、7dpf的体重和体长明显下降。 （3）微囊藻毒素和纳米塑料、微塑料暴露影响了胚胎畸形和孵化延迟：5μg/LMCLR+80nmPS-NPs、25μg/LMCLR+5μmPS-MPs组与单暴露组5μmPS-MPs、5μg/LMCLR、25μg/LMCLR组相比存活率明显下降；在72、96dpf，共暴露组出现了不同程度的孵化延迟；在120、144dpf时，5μg/LMCLR+80nmPS-NPs、25μg/LMCLR+80nmPS-NPs组出现畸形幼鱼。 2.亲代微囊藻毒素和纳米塑料、微塑料暴露导致子代斑马鱼心脏扩大，出现心包水肿以及SV-BA距离增加。 （1）共暴露导致子代出现心包水肿：5μg/LMCLR+80nmPS-NPs、25μg/LMCLR+80nmPS-NPs与对照和单暴露5μmPS-MPs、5μg/LMCLR、25μg/LMCLR组相比心包明显扩大，心脏阻塞，血瘀，心包水肿。 （2）共暴露导致子代心脏SV-BA距离增加：随着暴露剂量的增加，心脏拉长成线形，SV-BA距离增加。 3.亲代微囊藻毒素和纳米塑料、微塑料暴露引起了ROS过量产生，引起氧化应激激活、心区细胞凋亡和心脏组织结构改变。 （1）与单暴露组相比共暴露5μg/LMCLR+5μmPS-MPs、5μg/LMCLR+80nmPS-NPs组心脏荧光强度明显增加。 （2）MCLR与M/NPS暴露可导致氧化应激，其作用机制是破坏细胞中抗氧化酶的结构，并诱导脂质过氧化，从而导致斑马鱼心肌细胞凋亡,结果显示5μg/LMCLR+80nmPS-NPs、25μg/LMCLR+80nmPS-NPs组与对照组和单暴露组相比心脏区域出现大量点状绿色荧光。 （3）随着剂量增加，共暴露组的GSH活性与对照组相比显著降低，SOD和MDA含量显著上升，说明子代出现了明显的脂质过氧化现象。 （4）AO细胞凋亡检测发现，对照组心脏区域没有绿色荧光，而剂量组随着浓度增加，心脏区域点状荧光明显，上述结果说明，亲代暴露引起了斑马鱼幼鱼心脏细胞的凋亡，呈剂量依赖性。 （5）在4dpf时，对照组心脏结构完整呈球形，心房心室形状清晰，随着浓度剂量的升高，各组心脏结构开始出现变化，25μg/LMCLR组时心脏拉长成线型，25μg/LMCLR+80nm组心脏充血变形，心血管堵塞，心脏功能受损。 4.亲代微囊藻毒素和微塑料、纳米塑料共暴露后相关基因表达情况。 （1）亲代共暴露导致心脏发育相关基因改变：在4dpf时，心脏发育基因gata4、tbx5和WNT通路心脏基因fzd，在共暴露5μg/LMCLR+80nm、25μg/LMCLR+80nm、25μg/LMCLR+5μm组与单暴露5μg/LMCLR、25μg/LMCLR组相比转录水平相比明显下调。 （2）亲代共暴露导致组蛋白甲基化相关基因改变：H3K27me3去甲基酶UTX（kam6a）、Jmjd3(kam6b)和UTX的靶基因hodx11，在4dpf时，5μg/LMCLR+80nm、25μg/LMCLR+80nm组相比，转录水平明显下调（Plt;0.05）。 （3）在7dpf时，H3K27me3去甲基酶UTX和Jmjd3，5μg/LMCLR+5μm组与5μg/LMCLR、5μg/LMCLR+80nm组的转录水平明显下调，而UTX的靶基因hodx9、10、11在25μg/LMCLR+5μm、25μg/LMCLR+80nm组与5μg/LMCLR、25μg/LMCLR相比，转录水平下调明显。 （4）在4dpf时H3K27me3去甲基酶以及UTX靶基因在幼鱼体内可能出现减少或缺失的情况，影响了子代的生长，导致了心脏损害的发生，而7dpf时部分基因表达水平明显上调说明了斑马鱼幼鱼心脏具有极强的修复能力，能够快速修复受损的心脏。 5.亲代共暴露后采用染色质免疫共沉淀（ChromatinImmunoprecipitation，CHIP)-qPCR法测定4天UTX启动子区域组蛋白修饰水平。 （1）组蛋白修饰参与微囊藻毒素和纳米塑料、微塑料共暴露介导的UTX的长期抑制表达，与NC组相比，亲代共暴露后子代斑马鱼幼鱼中UTX区域附近组蛋白甲基化修饰H3K27me3富集水平的上升（Plt;0.05），有统计学意义。 结论： 亲代微囊藻毒素和纳米塑料、微塑料暴露后会诱导组蛋白甲基化修饰，引起子代早期心脏发育异常。为了探究微囊藻毒素和纳米塑料、微塑料在其中的具体作用机制。微囊藻毒素和塑料、纳米塑料共暴露后氧化应激激活，导致过量的活性氧生成，诱导组蛋白甲基化，阻碍了转录激活。综上所述，代微囊藻毒素和纳米塑料、微塑料共暴露后氧化应激激活诱导组蛋白甲基化修饰，阻碍了WNT信号通路传导，引起子代早期心脏发育异常。
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