摘要
中风是成人死亡和获得性残疾的主要原因，其中的缺血性中风对人类健康已构成巨大威胁；然而，目前有效的治疗方法有限。已知的心脑血管危险因素促进大脑内皮功能障碍，导致血管舒张受损，炎症反应加重，以及氧化应激和血管增生增加，这在血栓炎症反应中达到顶峰，这是缺血性中风的潜在原因。当缺血一段时间后血液回流到大脑时，这些事件会进一步加剧，这种现象被称为缺血-再灌注（Ischemia-reperfusion,I/R）损伤。无论涉及何种组织或器官，血管内皮都是缺血-再灌注损伤严重程度的关键靶点。内皮细胞可以通过内皮型一氧化氮合酶（Endothelialnitricoxidesynthases,eNOS）催化L-精氨酸合成一氧化氮（Nitricoxide,NO）。NO/cGMP信号通路是缺血时血管生成和组织灌注的中心调节因子，THBS1信号通路通过其受体CD47有效抑制NO生物合成和血管细胞的信号通路。然而THBS1在缺血-再灌注损伤中诱导的脑血管内皮功能障碍的机制尚未完全阐明。 目的： 动物水平上，探讨THBS1在脑缺血再灌注小鼠脑血管内皮功能损伤中的作用及机制；细胞水平上，验证氧糖剥夺及复氧糖对BMECs中THBS1蛋白表达的影响及THBS1对eNOS的调节作用。为预防和治疗脑缺血再灌注造成的脑血管损伤提供新的分子机制。 方法： 1.实验小鼠随机分为模型组和假手术组，采用颈外进线栓法阻塞小鼠中动脉，脑缺血1.5h，再灌注24h后取脑进行TTC染色并计算脑梗死体积。 2.用血管张力测定仪检测THBS1蛋白及脑缺血再灌注损伤对小鼠脑基底动脉舒张功能的影响。 3.用免疫荧光鉴定原代培养的小鼠BMECs。 4.用Westenblot技术检测氧糖剥夺及复氧复糖对BMECs中THBS1、eNOS蛋白表达的影响。 5.用钙离子成像技术检测氧糖剥夺及复氧复糖对BMECs钙内流的影响。 6.用NO荧光探针检测氧糖剥夺及复氧复糖对BMECsNO释放的影响。 结果： 1.脑卒中患者血浆中THBS1表达明显增加。 2.与WT（Wildtype,WT）缺血组小鼠相比，THBS1-/-小鼠缺血后脑梗死体积明显减小。 3.缺血再灌注后，THBS1在WT小鼠基底动脉内皮上的表达增多。 4.与对照组相比，THBS1孵育组基底动脉内皮依赖性舒张明显减弱，内皮非依赖性舒张没有明显影响。 5.与WT小鼠相比，THBS1-/-小鼠基底动脉内皮依赖性舒张显著增强；WT小鼠和THBS1-/-小鼠与各自对照组相比I/R后基底动脉内皮依赖性舒张均显著降低； 6.与WT小鼠的I/R模型相比，THBS1-/-小鼠I/R后的基底动脉内皮依赖性舒张明显增强。 7.测序结果发现敲除THBS1后，eNOS（又称NOS3）表达明显升高，用免疫蛋白印迹验证了此结果。 8.缺血再灌注体外模型中，相较于氧糖剥夺，复氧糖对BMECs中THBS1的表达影响更大，一定时间内THBS1表达成时间依赖性增加。 9.与WT小鼠相比，敲除THBS1后，BMECs释放的NO减少；与对照组相比，WT小鼠OGD/G后BMECs释放的NO减少，而对THBS1-/-小鼠细胞内NO释放无明显影响。 10.THBS1能够减弱WT小鼠BMECsSOCE幅度，即钙离子内流减少。敲除THBS1后SOCE的主要成分Orai1、STIM1蛋白表达增加。 结论： 本研究发现WT小鼠脑缺血再灌注后基底动脉内皮上THBS1表达增加，而且基底动脉的内皮依赖性舒张明显减弱，外源性的THBS1能够减弱基底动脉内皮依赖性舒张，同时，我们用THBS1-/-小鼠验证了THBS1与缺血再灌注后脑血管功能受损相关。之后我们利用RNA-Sequences技术对原代培养的BMECs处理后进行测序，筛选出与血管的内皮功能障碍相关的基因（比如eNOS），并验证THBS1的变化对其影响。体外实验中，我们证明了氧糖剥夺及复氧糖对BMECs中THBS1表达及对NO释放的影响。
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