摘要
猪链球菌2型（Streptococcussuisserotype2,SS2）是革兰氏阳性菌，为人畜共患病原菌，它可以破坏宿主血脑屏障（Bloodbrainbarrier,BBB）侵入中枢神经系统，引起猪和人的脑膜炎。烯醇化酶（Enolase,ENO）是一种关键的糖酵解催化酶，同时也是SS2重要的毒力因子。本课题组前期发现ENO刺激人脑微血管内皮细胞（Humancerebralmicrovascularendothelialcells,HCMECs）促进核糖体蛋白SA（RibosomeproteinSA,RPSA）从胞内向胞膜转移并在细胞膜表面和波形蛋白(Vimentin,VIM)相互作用形成复合体，从而介导细胞凋亡。 RPSA在细胞核、细胞器、细胞质、细胞膜和胞外囊泡中广泛表达。病原微生物感染宿主细胞后，RPSA往往会异位于细胞膜表面，介导微生物的感染。VIM是内皮细胞的主要中间丝蛋白，其在病原微生物过程中对于线粒体的保护起到重要作用。ENO刺激下，RPSA-VIM复合体介导细胞凋亡的作用机制尚不明确。因此，为了阐明RPSA-VIM在ENO刺激HCMECs凋亡过程中的作用，本文展开以下研究。 1、ENO破坏细胞线粒体功能，诱导HCMECs发生细胞凋亡。 首先为了探究SS2-ENO对细胞线粒体功能的影响，本文检测SS2感染以及ENO刺激下线粒体活性、线粒体膜电位、细胞活性氧含量(Reactiveoxygenspecies,ROS)和细胞Ca2+含量等指标，判断SS2以及ENO对细胞线粒体的损伤；之后为了验证ENO刺激是否通过激活宿主细胞线粒体凋亡途径触发凋亡，本研究使用qPCR检测了ENO刺激下线粒体凋亡相关因子的转录水平；最后为了验证ENO损伤宿主细胞线粒体对细胞凋亡的影响，我们在SS2感染以及ENO刺激下通过添加线粒体保护剂（MTP131）减缓线粒体损伤，采用流式细胞术检测细胞凋亡水平。结果发现，SS2和ENO蛋白刺激HCMECs，使线粒体活性下降、线粒体膜电位下降以及细胞内ROS和Ca2+水平显著升高，anti-ENO封闭SS2表面ENO可以减轻对细胞线粒体的损伤作用；qPCR结果显示促凋亡因子转录水平增加，抗凋亡因子转录水平下降，且BAX/BCL-2转录水平的比值显著增加；流式细胞术检测发现线粒体保护剂处理可以抑制ENO诱导细胞凋亡。因此，ENO刺激破坏了HCMECs线粒体功能，最终导致细胞发生凋亡。 2、Ca2+促进ENO诱导细胞发生凋亡。 大量研究表明，Ca2+与细胞凋亡直接相关。为进一步研究ENO刺激下，线粒体损伤导致的细胞凋亡过程是否与胞内升高的钙离子有关，本研究利用免疫荧光、蛋白免疫印迹法（Westernblot,WB）和流式细胞术等生物学技术手段，通过添加钙离子和胞内钙离子螯合剂（EGTA-AM）探究ENO刺激下，胞外Ca2+和胞内Ca2+对细胞凋亡的影响。免疫荧光和WB结果表明胞外Ca2+可以显著促进ENO对细胞的结合；流式细胞术验证发现Ca2+显著促进ENO诱导细胞凋亡，并且使用胞内Ca2+螯合剂之后，可以抑制ENO刺激对细胞凋亡的影响。因此，ENO损伤宿主细胞线粒体，使胞内Ca2+水平升高，诱导细胞发生凋亡。 3、RPSA-VIM介导ENO损伤宿主细胞线粒体，诱导细胞凋亡。 ENO刺激促进RPSA-VIM复合体形成，并且破坏细胞线粒体功能，导致细胞凋亡。然而，RPSA-VIM复合体与ENO损伤宿主细胞线粒体是否有关尚不明确。本研究为了阐明RPSA-VIM介导ENO损伤宿主细胞线粒体功能，ENO刺激下使用特异性抗体阻断和基因干扰的方法抑制ENO与RPSA-VIM复合体的相互作用，检测对线粒体膜电位、细胞活性氧含量以及胞内钙离子含量的影响，最终揭示ENO、RPSA-VIM和线粒体损伤之间的关系。结果显示，使用anti-RPSA和anti-VIM封闭细胞膜RPSA和VIM之后细胞活性氧含量和线粒体Ca2+含量显著下降；线粒体膜电位也趋于正常水平。干扰RPSA或VIM的蛋白表达后，对细胞线粒体的损伤也有所缓解。这些表明ENO通过RPSA-VIM途径损伤细胞线粒体功能，造成细胞凋亡。 综上，本研究阐明了SS2感染过程中，ENO通过作用RPSA-VIM复合体损伤宿主细胞线粒体功能，引起胞内钙离子升高，导致细胞凋亡。本研究丰富了SS2的致病机制，为SS2脑膜炎的预防和药物治疗提供新的靶点。
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