摘要
研究目的: 抑郁障碍是常见的精神障碍类疾病，早期应激作为其发病的重要危险因素，会导致神经发育轨迹发生永久性改变，造成海马区突触可塑性受损，进而造成抑郁障碍易感性增加。因此，积极探讨早期应激对抑郁障碍发病影响的机制和寻求相关药物干预，将为抑郁障碍的防治提供策略。逍遥散是临床治疗多种抑郁障碍的经典方剂，前期研究发现逍遥散可通过保护神经细胞和提高突触可塑性，改善肝郁脾虚证抑郁模型动物抑郁、焦虑样行为，发挥抗抑郁作用。 本研究拟采用母婴分离的方式模拟早期应激，并予慢性束缚应激模拟再次应激，建立具有早期应激经历的抑郁障碍模型，探讨早期应激对再次应激的影响及机制;并予逍遥散干预，研究逍遥散对早期应激抑郁障碍的干预机制，以期为抑郁障碍早期预防和治疗提供思考和方向。 研究方法: 实验一:早期应激对再次应激易感性的影响 采用 SPF 级 C57BL/6J 孕鼠(gestation day 17-18 天)，作为本实验的母鼠，随后选择36只子代雄性小鼠作为研究对象，随机分为对照组(Control 组)、慢性束缚应激组(Chronic Restraint Stress,CRS 组)、母婴分离(Maternal Separation,MS)联合慢性束缚应激组(MS+CRS组)。 具体操作流程如下:在仔鼠生后1-21天(PND1-21)每天上午8:00-12:00,将母鼠从原饲养笼中移出，放置在新笼中，置于另一间实验间，与仔鼠分离，4小时/天，连续21天，所有仔鼠于PND22断奶，辨明性别，选取雄性仔鼠用于本实验研究，PND22选取雄性仔鼠后，将仔鼠编号分组。PND22-38所有仔鼠在充足的水分和饲料下正常饲养，不予任何干预和刺激。PND39-60 MS+CRS组、CRS组仔鼠进行慢性束缚应激，3小时/天。PND61-68通过旷场实验、新物体识别、高架十字迷宫、水迷宫等行为学检测小鼠抑郁焦虑样行为、学习记忆能力;PND69取材，用ELISA法检测小鼠血清CORT水平。 实验二:探讨早期应激对小鼠海马区突触可塑性的影响及机制 在实验一的基础上，采用RT-qPCR、Western Blot检测各组小鼠海马区突触蛋白PSD95、synaptophysin mRNA和蛋白表达水平;Western Blot检测小鼠海马区p-mTOR、t-mTOR、p-S6、t-S6蛋白表达水平。 实验三:逍遥散调控BDNF-ERK-mTOR/S6通路减轻早期应激抑郁障碍小鼠突触可塑性损害 采用SPF级C57BL/6J孕鼠作为本实验的母鼠，随后选择48只子代雄性小鼠作为研究对象，随机分为4组，除Control组外，MS+CRS组、逍遥散组、氟西汀组小鼠均采用MS+CRS建立早期应激抑郁障碍模型。在PND39-60灌胃给予相应药物干预，Control组、MS+CRS组均予去离子水灌胃，逍遥散、氟西汀组分别给予逍遥散、盐酸氟西汀混悬液。 观察小鼠宏观表征，每周测量体重变化;PND61-68通过旷场实验、新物体识别、高架十字迷宫、水迷宫等行为学检测进行评价，观察逍遥散对模型小鼠行为学的影响。通过透射电镜观察小鼠海马CA1区突触超微结构改变;Western Blot检测突触蛋白PSD95、synaptophysin蛋白表达水平;Western Blot 检测 BDNF、p-ERK、t-ERK、p-mTOR、t-mTOR、p-S6、t-S6蛋白表达水平;同时采用免疫组化法对其上述分子蛋白表达进行定位分析。 研究结果: (1)早期应激增加了再次应激的易感性:①旷场实验:与Control组对比，CRS组、MS+CRS组小鼠在旷场中央区停留时间减少，且MS+CRS组停留时间明显少于CRS组。②高架十字迷宫:与Control组相比，CRS组和MS+CRS组小鼠进入开放臂的次数和在开放臂停留时间均减少，MS+CRS组在开放臂的停留时间较CRS组更少。③新物体识别:CRS组小鼠识别指数(RI值)与Control组无差异，而MS+CRS组小鼠的RI值与Control组、CRS组比较均有显著性差异。④水迷宫:空间记忆采集实验中，在训练第4天，与Control组比较，MS+CRS组小鼠潜伏期明显增加;空间探索实验中，MS+CRS组小鼠目标象限停留的时间、穿越逃生平台的次数较Control组均减少。而与Control组相比，CRS组空间记忆采集实验、空间探索实验中均无显著差异。⑤早期应激对小鼠血清CORT的影响:与Control组相比，CRS组、MS+CRS组小鼠血清CORT水平明显升高，CRS组与MS+CRS组间无差异。 （2）早期应激降低了小鼠海马区突触蛋白PSD95和synaptophysin 表达水平:与 Control 组相比，CRS 组、MS+CRS 组小鼠海马PSD95和synaptophysin mRNA、蛋白表达水平均降低。与CRS组相比，MS+CRS组小鼠海马PSD95 mRNA表达水平无差异，但PSD95蛋白表达水平更低;MS+CRS组synaptophysin mRNA、蛋白水平均明显低于CRS组。 （3）早期应激降低了小鼠海马区mTOR/S6通路的活性:Control组、CRS组、MS+CRS组小鼠t-mTOR、t-S6蛋白表达水平无差异。与 Control 组相比，CRS 组和 MS+CRS 组的 p-mTOR（S2448）和 p-S6（S240/244）明显减少;与CRS组相比，MS+CRS组的p-mTOR和p-S6水平降低更明显。 （4）逍遥散对早期应激抑郁障碍小鼠宏观表征、体重及行为学的影响:①宏观表现:PND1-21母婴分离期间，Control组、MS+CRS组、逍遥散组、氟西汀组4组小鼠吃奶、活动未见明显异常。PND22-38,除Control组外，其余3组小鼠间断出现大便不成形，且笼内撕咬行为增多、体重测量时易激惹;PND39-60予以慢性束缚应激后，MS+CRS组、逍遥散、氟西汀组3组小鼠脱毛、易激惹、挣扎及撕咬明显增多，随着束缚应激时间的延长，在束缚应激第3周（即PND53-60）MS+CRS组小鼠出现扎堆蜷缩，在束缚筒内挣扎减少、排尿增多、排便不成形;逍遥散、氟西汀组小鼠在束缚筒内仍挣扎有力。②体重:PND22天断乳时4组小鼠体重为同一水平，PND22-38各组小鼠体重增长明显但各组小鼠体重无明显差异。PND39开始予以慢性束缚应激，连续3周，PND46、PND53（即慢性束缚应激第1周末、第2周末），4组小鼠体重均增加，Control组小鼠体重增加明显，但4组小鼠组间比较无差异。PND60（慢性束缚应激第3周末），Control组、逍遥散、氟西汀组小鼠体重仍呈增长趋势，而MS+CRS组小鼠体重降低，且与Control组比较具有差异，逍遥散、氟西汀组小鼠与MS+CRS组比较体重稍高，但差异均不具有统计学意义。③旷场实验，与Control组相比，MS+CRS组小鼠在旷场中央停留时间显著缩短，用逍遥散、盐酸氟西汀药物干预后小鼠在中央区停留时间均增加，两组间无明显差异。④高架十字迷宫，MS+CRS组小鼠在开放臂停留时间、进入开放臂的次数都明显少于Control组，用逍遥散干预后在开放臂停留时间增多，但进入开放臂的次数与Control组相比并无差异，而予氟西汀干预后小鼠进入开放臂次和在开放臂停留时间均显著增加。⑤新物体识别，MS+CRS组小鼠识别指数（RI值）显著低于Control组，逍遥散能显著提高小鼠的RI值。⑥水迷宫，在空间记忆采集实验第3-4天，与Control组比较，MS+CRS组进入平台潜伏期延长;与MS+CRS组相比，逍遥散、氟西汀组潜伏期缩短，两组间相比无差异。与Control组相比，MS+CRS组小鼠在目标象限停留的时间、穿越逃生平台的次数均减少;空间探索实验中，MS+CRS组小鼠较Control组目标象限停留的时间、穿越逃生平台的次数均减少;与MS+CRS组相比，逍遥散、氟西汀组目标象限停留的时间、穿越逃生平台的次数均增加，两组间无差异。 （5）逍遥散对小鼠海马CA1区突触超微结构的影响:透射电镜下Control组小鼠突触结构完整、前后膜清晰、后膜致密物丰富,MS+CRS组突触前后膜边界破坏、不清晰，后膜致密物稀疏，而逍遥散、氟西汀干预后，突触结构仍欠清晰，后膜致密物增加。 研究结论: (1)采用母婴分离模拟早期应激，慢性束缚应激模拟再次应激,证实了早期应激增加再次应激的易感性，是抑郁障碍发生的危险因素。 (2)早期应激增加再次应激易感性的机制可能与降低mTOR-S6信号通路活性，减少突触相关蛋白PSD95和synaptophysin合成，降低突触可塑性有关。 (3)用母婴分离联合慢性束缚应激(MS+CRS)建立了早期应激抑郁障碍小鼠模型，逍遥散可改善早期应激抑郁障碍小鼠抑郁焦虑样行为、认知功能损害，表明疏肝健脾法治疗早期应激抑郁障碍有效。 (4)逍遥散可通过促进BDNF/ERK/mTOR-S6通路活化，增加突触相关蛋白合成，修复突触结构损害以治疗早期应激抑郁障碍，阐释了逍遥散防治早期应激抑郁障碍的科学内涵。
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