摘要
研究背景： 外周T细胞淋巴瘤（PeripheralT-celllymphoma,PTCL）是起源于胸腺后T淋巴细胞或成熟NK细胞的一组具有高度异质性的非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkinlymphoma,NHL），在亚洲人群中的发病率明显高于欧美人群。然而，目前PTCL缺乏特异性的有效治疗手段，大部分患者对传统一线化疗方案CHOP/CHOP样方案不敏感，患者复发率高、预后差，给临床治疗带来了严峻的挑战。虽然目前一些分子靶向药物的研发与应用给PTCL的治疗带来了新的曙光，但是不同药物的疗效各异，大多数药物的疗效尚缺乏大规模人群队列研究的支持。因此，寻找新的药物治疗靶点仍然是目前PTCL精准治疗和个性化治疗的重中之重。 组织蛋白酶L（CathepsinL,CTSL）是半胱氨酸蛋白酶家族成员，广泛参与蛋白质水解、抗原呈递、细胞凋亡、T淋巴细胞分化等多个生理过程。人群研究发现CathepsinL在肺癌、结直肠癌、乳腺癌、黑色素瘤、子宫内膜癌等多种恶性肿瘤中表达升高，可能与这些恶性肿瘤的进展、侵袭、代谢、复发、预后等相关。与CathepsinB、K、S、C等其他家族蛋白相比，CathepsinL仅在肿瘤细胞内表达增多，而在癌旁组织正常表达（处于微量表达或极微量表达水平）。因此，CathepsinL被认为是促进恶性肿瘤发生发展的重要因子之一，有望成为未来治疗恶性肿瘤的分子靶标。遗憾的是，关于CathepsinL在PTCL中表达情况及其可能作用尚无系统研究。 研究目的： 基于此，本研究旨在确定CathepsinL在PTCL肿瘤组织及其对照组织中的差异表达情况，初步揭示CathepsinL在PTCL中的可能作用。 研究方法： 本研究采用的是生物信息学联合多组学分析。首先，通过公共生物数据库分析CathepsinL在PTCL与对照组织中的差异表达情况，利用已收集的初诊PTCL患者的肿瘤标本进行免疫组化检测加以验证；然后，在体外通过shRNA干扰技术构建CathepsinL稳定低表达的Jurkat和Hut78两种PTCL细胞株，利用蛋白印迹方法验证两种细胞株CathepsinL的敲低情况；其次，采用转录组学（RNAseq）分析两组PTCL细胞株的敲低组与对照组差异表达基因，利用RT-PCR检测进行验证，通过GO和KEGG分析可能涉及的生物学信号通路；最后，利用凋亡蛋白芯片检测Jurkat细胞敲低组和对照组之间的差异表达蛋白，用ELISA检测两组细胞间上述差异蛋白的表达水平，从而验证RNAseq关于CathepsinL在PTCL细胞凋亡中的作用。 研究结果： 通过TIMER、Oncomine和GEO数据库联合分析，我们发现CathepsinL在泛癌，尤其是PTCL中表达显著升高，PTCL人群肿瘤组织样本免疫组化检测同样发现CathepsinL表达增多；HPA数据库和CIBERSORT工具分析发现，CathepsinL在正常T细胞亚群中处于低表达或极低表达水平，不同免疫细胞浸润情况的改变构成了PTCL肿瘤的微环境；基因富集分析发现与PTCL中CathepsinL可能相关的信号通路包括溶酶体、凋亡、自噬、抗原加工与提呈等通路。为了探讨CathepsinL在PTCL中的可能作用，我们采用了RNAi技术编辑Jurkat细胞和Hut78细胞，通过荧光显微镜和流式细胞仪证实细胞感染率符合研究需要，RT-PCR和Westernblot结果证实CathepsinL基因敲低后的Jurkat细胞和Hut78细胞CathepsinL的表达显著降低，证实我们成功构建了CathepsinL稳定低表达的Jurkat细胞和Hut78细胞。 接下来，RNAseq分析发现：对比CTSLlowJurkatvs.VectorJurkat细胞数据集共发现了602个差异表达基因，对比CTSLlowHut78vs.VectorHut78数据集共发现了32个差异表达基因；两个数据集共同差异表达基因共8个，分别是：PAK4、FUS、HSPD1、LEF1、RRM2、CHAC1、SLC7A5、SESN2，RT-PCR结果证实上述基因确实存在差异表达。通过基因功能富集分析发现这些差异表达基因主要涉及谷胱甘肽代谢、p53信号通路途径。凋亡蛋白芯片检测结果发现，对比CTSLlowJurkatvs.VectorJurkat细胞数据集共发现了8个差异表达蛋白，分别是IGFBP-6、Fas、sTNF-R1、Bax、IGFBP-1、IGF-1sR，且ELISA检测结果证实了促凋亡相关蛋白Fas、Bax、sTNF-R1、IGFBP-6存在差异表达。通过功能富集分析，证实了p53信号通路在CathepsinL敲低前后存在显著差异。 研究结论： 基于此，我们认为在PTCL中CathepsinL在肿瘤组织中的表达显著升高。过表达的CathepsinL可能通过p53信号通路作用于细胞凋亡，参与PTCL的发病过程。此外，我们还成功构建了两种CathepsinL稳定低表达的PTCL细胞株，可以为后续研究提供体外实验工具。
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