咖啡因抑制脂质新生和MyD88棕榈酰化改善肝内AKT过表达诱导的脂肪性肝炎作用研究

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中文摘要：目的: 非酒精性脂肪肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是一种由代谢、环境和遗传易感性因素引起的弥漫性肝实质细胞脂肪变性的临床综合征。非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis,NASH)是NAFLD进展过程中的关键亚型，发病机制复杂，在社会存在防治意识薄弱、患者趋向年轻化和特效药物缺乏等问题，临床上治疗和预防面临着巨大的挑战。咖啡因是一种从茶叶和咖啡豆中提取出来的生物碱，系黄嘌呤类化合物。近年来流行病学研究和荟萃分析显示常饮用咖啡人群的代谢综合征类疾病如NAFLD的发病率明显低于正常人群，体现了咖啡因对肝脏的潜在保护作用，但其在NASH中对肝细胞的直接抗炎功效尚未见报道。本研究通过尾静脉高压水流动力学注射技术建立肝内AKT过表达诱导的脂肪性肝炎小鼠模型，对咖啡因治疗NASH的作用进行系统研究。并在明确咖啡因具有改善NASH的作用基础上开展机理研究，重点探究了咖啡因通过抑制AKT/mTOR/SREBP-1级联反应和FASN依赖的MyD88棕榈酰化改善NASH的分子机制。本研究旨在为NASH的新药研发提供临床前实验依据和理论基础。方法: 1.FVB/N小鼠随机分成4组:对照组、模型组、咖啡因低剂量组(AKT-Caffeine-L)、咖啡因高剂量组(AKT-Caffeine-H)。模型组、咖啡因低剂量组、咖啡因高剂量组中通过尾静脉高压水流动力学注射法联合注射pT3-EF1α-HA-myr-AKT和pCMV/SB建立小鼠脂肪性肝炎模型。注射3天后，咖啡因低、高剂量组通过灌胃法予以咖啡因(15或30mg/kg/d),对照组和模型组则同步予以等量生理盐水，连续5周。实验结束后，安乐处死小鼠。运用免疫组织化学和Western Blotting法验证尾静脉高压水流动力学注射AKT的效率;观察小鼠肝脏的形态学;苏木精-伊红(H&E)染色法及油红O染色法观察小鼠肝脏病理学特征;生化试剂盒检测小鼠血清或肝组织中丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C),高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)等含量。 2.Western Blotting、RT-qPCR或免疫组织化学染色法检测咖啡因对小鼠肝脏中 p-AKTThr308/t-AKT、p-mTOR、p-RPS6/RPS6、SREBP-1、ACC、FASN 和 IL-6、TNF-α、p-IκBα/IκBα、p-p65/p65 等蛋白或 mRNA 表达水平的影响;酶联免疫吸附测定法检测小鼠肝脏中IL-6和TNF-α水平的变化;酰基-生物素交换法(Acyl-Biotin exchange,ABE)检测咖啡因对小鼠肝中MyD88的棕榈酰化水平的影响。 3.通过AKT基因质粒瞬时转染或胰岛素诱导构建AKT激活体外细胞模型。Western Blotting法检测咖啡因对AKT瞬时转染和胰岛素诱导的HepG2、Huh-7 细胞中 p-AKTTr308/t-AKT、p-mTOR、p-RPS6/RPS6、SREBP-1、ACC、FASN等蛋白表达水平的影响;运用ABE法和免疫共沉淀酰基-生物素交换法(Immunoprecipitation-ABE,IP-ABE)检测咖啡因对AKT瞬时转染的HepG2、Huh-7细胞中MyD88的棕榈酰化水平的影响;Western Blotting法检测咖啡因对AKT瞬时转染的HepG2、Huh-7 细胞中 IL-6、TNF-α、p-IκBα/IκBα、p-p65/p65 等蛋白表达水平的影响;酶联免疫吸附测定法检测咖啡因对AKT瞬时转染的HepG2、Huh-7细胞中IL-6和TNF-α水平的变化。结果: 1.肝内AKT过表达增加了肝脏重量，促进了肝脏脂肪变性和炎症损伤。咖啡因(15或30mg/kg)给药后，小鼠肝脏脂肪化程度显著减轻，炎性细胞浸润现象明显减少，肝脏功能指标(AST/ALT)和血脂指标(TG、TC、IDL-C、HDL-C)异常得到了有效改善。 2.咖啡因显著下调了脂肪性肝炎小鼠肝中p-AKTThr308、p-mTOR、p-RPS6、SREBP-1、ACC、FASN 和 IL-6、TNF-α、p-IκBα、p-p65 的蛋白或mRNA表达水平;咖啡因显著减少了脂肪性肝炎小鼠肝中IL-6和TNF-α的含量;咖啡因能够明显减少脂肪性肝炎小鼠肝脏中MyD88棕榈酰化修饰水平。 3.咖啡因显著下调了 AKT瞬时转染或胰岛素诱导的HepG2、Huh-7细胞模型中 p-AKTThr308、p-mTOR、p-RPS6、SREBP-1、ACC、FASN 的蛋白表达;咖啡因减少了 AKT瞬时转染HepG2、Huh-7细胞模型中MyD88棕榈酰化修饰水平;咖啡因显著下调了 AKT瞬时转染的HepG2、Huh-7 细胞模型中 IL-6、TNF-α、p-IκBα、p-p65 的蛋白表达;咖啡因显著减少了 AKT瞬时转染的HepG2、Huh-7细胞中IL-6和TNF-α的水平。结论: 咖啡因对肝内AKT过表达诱导的小鼠脂肪性肝炎具有一定的改善作用，其作用机制可能是通过抑制AKT/mTOR/SREBP-1级联反应和FASN依赖的MyD88棕榈酰化，进而改善NASH发生前期的肝脏脂肪蓄积和炎性反应。本研究为咖啡因防治NASH提供了临床前实验依据和理论基础。

作者：

谈相云

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关键词：

非酒精性脂肪性肝炎咖啡因脂质新生 MyD88棕榈酰化抑制作用

授予学位：

硕士

学科专业：

药学

导师：

邱振鹏

学位年度：

2023

学位授予单位：

湖北中医药大学

语种：

中文

中图分类号：