摘要
肝细胞癌（hepatocellularcarcinoma,HCC）是最常见的原发性肝癌类型（90%），也是全球第三大癌症相关死亡原因。手术、放疗和化疗是目前肝癌治疗的主要手段，但由于肝癌早期诊断率低、复发率高等，总体治疗效果欠佳。异质性病因、复杂的肿瘤微环境和HCC的免疫调节需要具有新型靶向治疗的特定治疗策略。 目前有许多正在进行的关于HCC的III期临床试验，探索酪氨酸激酶抑制剂和免疫检查点抑制剂的组合，以及细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4抑制剂和其他免疫检查点抑制剂的组合。该领域的下一个重大挑战是确定新的联合治疗方案，提高患者的总体生存率。 研究表明，吉西他滨可以调节肿瘤免疫微环境，特别是清除骨髓源性抑制细胞（myeloid-derivedsuppressorcells，MDSCs）以激活内源性抗肿瘤免疫应答。因此，化学免疫疗法可能引发强大的抗肿瘤免疫力。基于吉西他滨进行肿瘤化疗的一些缺陷，如酶脱氨、快速的全身清除和通过下调细胞摄取产生的化疗耐药，我们研究了吉西他滨联合程序性细胞死亡蛋白-1（programmedcelldeathprotein1，PD-1）抗体在HCC中的治疗效果。 目的： 1.研究吉西他滨对HCC免疫原性微环境的改变。 2.研究吉西他滨联合PD-1抗体在不同HCC小鼠模型的治疗作用。 方法： 1.构建皮下H22-绿色荧光蛋白（greenfluorescentprotein，GFP）细胞接种模型，随机分为2组，分别是对照组和吉西他滨组（50mg/kg），每4天给药一次，共给药3次，收集肿瘤组织并消化以检查免疫细胞亚群，通过流式细胞术定量CD45+肿瘤浸润性免疫细胞，并进一步分析MDSCs和肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associatedmacrophages,TAMs）、CD4+T和CD8+T细胞的比例。通过蛋白免疫印迹（Westernblot）定量肿瘤组织中PD-1和PD-L1的表达水平；以及通过流式细胞术定量测定H22-GFP细胞上PD-L1的表达，以及CD3+肿瘤浸润性T细胞上PD-1的表达。 2.构建皮下H22-GFP细胞接种模型，随机将小鼠分为4组，分别是对照组，吉西他滨组（50mg/kg），αPD-1组（2.5mg/kg），以及吉西他滨联合αPD-1组，每4天给药一次，共给药3次，测量小鼠肿瘤体积并绘制肿瘤生长曲线。通过流式细胞仪检测小鼠肿瘤组织中白细胞介素（interleukin,IL）-2+CD8+T细胞占比。酶联免疫吸附试验（enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA）检测转化生长因子（transforminggrowthfactor,TGF）-β、IL-12p70和干扰素（interferon,IFN）-γ水平。3.H22荷瘤小鼠最终给药后4天，切除原发肿瘤组织并分离，在对侧皮下注射2×106个H22细胞建立肿瘤复发模型，在最终处理后4天，通过流式细胞术检查脾脏中CD8+和CD4+中央记忆T细胞（Tcentralmemorycells，TCMs）的比例。在首次治疗后第12至39天，评估每组肿瘤复发小鼠体内肿瘤体积变化，绘制肿瘤生长曲线，并统计每组无肿瘤小鼠的数量。 4.选取三种人源肝癌细胞HepG2、Hep3B和Huh7细胞，用10μM吉西他滨进行处理24小时后，通过Westernblot检测PD-L1的表达情况。将获取的肝癌病人肿瘤样本消化成单细胞后使用10μM吉西他滨处理24h，通过流式细胞仪检测T细胞上PD-1的表达情况。 5.构建Huh7人源化小鼠肿瘤移植模型，随机将小鼠分为4组，分别是对照组，吉西他滨单独给药组（50mg/kg），αPD-1单独给药组（2.5mg/kg），以及吉西他滨联合αPD-1给药组，每4天给药一次，一共给药4次，监测小鼠肿瘤生长情况。 结果： 1．吉西他滨治疗可以有效增加肿瘤组织中浸润性免疫细胞的比例，降低了CD45+细胞中MDSCs和TAMs的比例，提高了CD4+T和CD8+T细胞的比例。 2．吉西他滨治疗诱导PD-L1和PD-1过表达：吉西他滨治疗可以增加肿瘤组织中的相对PD-L1和PD-1的表达水平，与未处理的对照组细胞相比，H22-GFP细胞上的PD-L1表达上调；CD3+肿瘤浸润性T细胞上的PD-1表达上调。 3．吉西他滨联合αPD-1可上调IL-2+CD8+T细胞抑制H22肝癌的生长：与吉西他滨或αPD-1单药治疗相比，吉西他滨联合αPD-1治疗后皮下肿瘤体积显著减少，IL-2+CD8+T细胞的比例增加，下调TGF-β的分泌并上调IL12p70和IFN-γ的分泌。4．吉西他滨联合αPD-1可以有效抑制HCC复发：与吉西他滨或αPD-1单药治疗相比，吉西他滨联合αPD-1治疗后小鼠脾脏中CD8+TCM和CD4+TCM的比例均显著上调；吉西他滨联合αPD-1治疗显著改善了复发模型中无肿瘤的比例，从1/6提高至4/6，同时复发肿瘤体积显著减小。 5．吉西他滨处理诱导人源肝癌细胞高表达PD-L1：三组HepG2、Hep3B和Huh7细胞中，吉西他滨处理后的细胞中PD-L1的表达水平均高于对照组。吉西他滨处理病人肝癌组织单细胞悬液诱导T细胞高表达PD-1。 6．吉西他滨联合αPD-1有效抑制Huh7肝癌生长：相比单独注射吉西他滨组和单独注射αPD-1组，吉西他滨联合αPD-1用药组HCC肿瘤的大小和质量均显著减少。 结论： 1.吉西他滨可以增加CD8+T和CD4+T细胞成分的频率，降低肿瘤内MDSCs（CD11b+Gr-1+）和TAMs（F4/80+）。 2.吉西他滨联合PD-1抗体治疗可以进一步抑制HCC的生长和复发。
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