摘要
研究目的：心脏骤停是指由于心脏在收缩期不能有效收缩而导致全身血液循环突然停止，进而引起全身器官缺血缺氧及功能障碍。是一个世界范围内严重的公共健康问题。尽管CPR技术在不断改善，但心脏骤停的死亡率仍位居世界首位。复苏后心功能障碍（PRMD）是自主循环恢复后早期死亡的首要原因，其主要机制是心肌缺血/再灌注损伤（MIRI）。因此，降低CPR后死亡率的关键问题在于及时恢复心脏的泵血功能，尽早改善复苏后心肌损伤程度。卡格列净（CANA）是一种钠-葡萄糖协同转运蛋白2抑制剂（SGLT2）。相关研究表明，CANA对于心血管事件可发挥保护作用，且该作用独立于其降糖作用，但CANA对于心肌缺血/再灌注发挥保护作用的机制尚不清楚。本实验目的为通过体外建立H9c2心肌细胞H/R模型，观察CANA对H/R损伤是否发挥保护作用并且研究保护机制。 研究方法：通过对H9c2心肌细胞进行H/R处理，来模拟人体内心肌细胞H/R损伤。按照预定方案将H9c2心肌细胞随机分为5组：（1）CON（空白对照组）；（2）H/R组（缺氧/复氧组）；（3）H/R+CompoundC组（AMPK抑制剂对照组）；（4）H/R+CANA组（CANA预处理组）；（5）H/R+CANA+CompoundC组（CANA+AMPK抑制剂组）。CON细胞在完全培养基中进行常规培养；H/R组细胞进行12h缺氧和4h复氧处理；H/R+CompoundC组细胞在H/R损伤前置于含10μmol/L的AMPK抑制剂CompoundC的完全培养基中孵育12h；H/R+CANA组细胞在H/R损伤前在含10μmol/LCANA的完全培养基中孵育12h；H/R+CANA+CompoundC组细胞在H/R损伤前在含10μmol/LCANA的完全培养基中孵育12h，同时进行10μmol/L的AMPK抑制剂CompoundC孵育。将各组细胞进行相应处理结束后，采用CCK8法检测各组细胞活力、流式细胞术检测细胞凋亡率、ELISA法检测MDA和SOD等氧化因子以测定细胞内氧化应激损伤程度、LDH试剂盒检测细胞上清中LDH含量、Westernblot法测定AMPK/Sirt1/PGC-1α信号通路相关蛋白的表达水平。 研究结果：1.CANA对H/R诱导的H9c2心肌细胞损伤的影响：与CON组相比，H9c2细胞进行H/R诱导损伤后，CCK-8结果显示细胞活力显著降低（Plt;0.05），LDH含量明显升高（Plt;0.05）。SOD含量降低，而MDA含量明显升高（Plt;0.05）。CANA预处理可显著提高H9c2心肌细胞活力，增加SOD含量（Plt;0.05）；降低H9c2心肌细胞LHD、MDA含量（Plt;0.05）。 2.CANA对H/R诱导的H9c2心肌细胞凋亡的影响：通过流式细胞术结果显示，H/R引起的细胞凋亡率明显高于Control组（Plt;0.05）。然而，用CANA预处理后，H/R诱导的细胞凋亡显著减少（Plt;0.05）。 3.CANA对H/R诱导的H9c2心肌细胞能量代谢的影响：为探讨CANA是否通过AMPK/Sirt1/PGC-1α信号通路对H9c2心肌细胞能量代谢发挥作用。Westernblot结果显示，与Control组相比，H/R组p-AMPK/AMPK、Sirt1和PGC-1α比值显著降低，加入CANA后p-AMPK/AMPK、Sirt1和PGC-1α比值升高（Plt;0.05）。与H/R+CANA组相比，使用AMPK抑制剂（CompoundC）后，p-AMPK/AMPK、Sirt1和PGC-1α的比例显著降低（Plt;0.05）。 研究结论：1.CANA预处理可增强细胞活力，降低细胞膜的损伤程度。对H/R诱导的H9c2心肌细胞损伤发挥保护作用； 2.H9c2心肌细胞H/R后在氧化应激和凋亡两方面均发生了变化，CANA可调节H/R后的心肌细胞减少氧化应激、减少细胞凋亡，对心肌细胞发挥保护作用； 3.CANA可激活AMPK/Sirt1/PGC-1α信号通道改善H/R诱导的心肌细胞能量代谢，进而发挥其保护作用; 4.AMPK/Sirt1/PGC-1α信号通道抑制剂CompoundC可逆转CANA对H9c2心肌细胞H/R的保护作用。
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