摘要
目的：麻醉镇静药物的出现使复杂的手术和诊断程序能够安全地进行。然而，越来越多的临床观察和实验表明，麻醉药物可以引发中枢神经系统的形态和功能改变，特别是幼儿和老年人。目前较多的研究表明小胶质细胞吞噬功能的改变参与了多种中枢神经系统疾病的发生发展，脂质代谢在维持小胶质细胞吞噬功能方面起着重要作用。然而，麻醉药物对小胶质细胞脂质利用及吞噬功能的潜在影响尚不清楚。脂滴是特定的脂质储存器官，可降解为游离脂肪酸，为细胞提供能量。阐明麻醉药物对小胶质细胞脂滴降解和吞噬作用的影响对于发现术后中枢神经系统并发症的新治疗理念至关重要。 方法：在本研究中，我们使用了永生化小胶质BV2细胞探究了咪达唑仑对细胞脂滴和吞噬功能的影响，并揭示了自噬在其中的作用。对于BV2细胞脂滴水平的检测，实验中用0μM，5μM，15μM，25μM咪达唑仑处理BV2细胞24h，用15μM咪达唑仑处理BV2细胞0h，12h，24h，36h，用BODIPY493/503荧光探针对BV2细胞脂滴进行染色，并通过流式细胞术检测每组细胞平均荧光强度；通过甘油三酯定量试剂盒进一步检测BV2细胞甘油三酯水平。对于BV2细胞吞噬功能的检测，对照组用PBS处理，实验组用15μM咪达唑仑处理，24小时后，两组分别加入荧光黄绿色乳胶珠处理4小时，并通过荧光显微镜和流式细胞术来评估BV2细胞吞噬荧光黄绿色乳胶珠情况。使用长链酰基辅酶A合成酶抑制剂TriacsinC抑制脂滴的形成，通过荧光显微镜观察和流式细胞术检测抑制脂滴形成后BV2细胞吞噬荧光黄绿色乳胶珠情况。此外，对于BV2细胞自噬的检测，将实验分为对照组，咪达唑仑（15μM）处理组，雷帕霉素（2.5μM）处理组，雷帕霉素与咪哒唑仑共处理组，通过蛋白质印迹检测自噬相关蛋白p62和LC3水平来评估咪达唑仑对BV2细胞自噬的影响；使用mCherry-GFP-LC3B腺病毒感染细胞，在荧光显微镜下观察并统计自噬小体和自噬溶酶体情况，以评估自噬流水平。通过蛋白印迹检测磷酸化TFEB和总TFEB水平探究咪达唑仑抑制自噬流的机制。 结果：我们的研究发现，15μM咪达唑仑处理BV2细胞24小时后，与对照组相比，BV2细胞脂滴的平均荧光强度和细胞甘油三酯水平增加。荧光显微镜观察发现，与对照组相比，15μM咪达唑仑处理BV2细胞24小时，细胞吞噬的乳胶珠减少。流式细胞术检测同样发现，咪达唑仑处理后BV2细胞吞噬乳胶珠的平均荧光强度下降，吞噬乳胶珠的细胞减少。在使用长链酰基辅酶A合成酶抑制剂TriacsinC抑制脂滴的形成后，咪达唑仑处理的BV2细胞吞噬乳胶珠水平增加，吞噬乳胶珠的细胞增加。在自噬检测中，蛋白印迹检测发现，咪达唑仑处理的BV2细胞p62和LC3II蛋白水平均显著增加。雷帕霉素处理减少了咪达唑仑引起的p62蛋白水平增加。使用mCherry-GFP-LC3B腺病毒感染细胞后，在共聚焦显微镜下观察发现，与对照组相比，咪达唑仑处理组细胞形成的自噬小体增加，自噬溶酶体没有明显差异。而与单独咪达唑仑处理组相比，雷帕霉素与咪达唑仑共处理组细胞自噬溶酶体增加，自噬小体减少。另外，与对照组相比，咪达唑仑处理显著增加了BV2细胞中磷酸化TFEB蛋白水平，而与咪达唑仑处理组相比，雷帕霉素与咪达唑仑共处理降低了磷酸化TFEB水平。此外，与单独咪达唑仑处理组相比，雷帕霉素与咪达唑仑共处理组BV2细胞脂滴平均荧光强度和甘油三酯水平下降，并且吞噬更多的乳胶珠。 结论：咪达唑仑诱导小胶质细胞脂滴积累，并且引起细胞吞噬功能下降，抑制脂滴积累部分恢复咪达唑仑诱导的BV2细胞吞噬功能下降。咪达唑仑损害了BV2细胞自噬，雷帕霉素增强自噬可显著减少脂滴积累和改善吞噬功能下降。因此，促进自噬可能是减少脂滴积累的潜在治疗策略，脂滴的正常降解对于维持小胶质细胞吞噬功能和减轻咪达唑仑对中枢神经系统的副作用很重要。
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