摘要
目的： 透明带在卵泡发育、精子-卵子结合、顶体反应诱导、防止多精受精和输卵管运输中起着关键作用，因此透明带异常会损害卵母细胞的发育潜能。琼脂状透明带（Agar-likezonapellucida,AZP）在异常透明带中较为常见，其形态特点为：脱颗粒后倒置显微镜下透明带致密、透亮，呈均匀的琼脂样结构,卵周间隙完全或部分缺失。具有AZP的人类卵母细胞不能自然受精，因为精子无法穿过透明带进入细胞质内。在临床中尽早识别此类患者制定合适的受精方案往往是成功治疗的关键。然而，由于AZP发病隐匿，发病机制未明，且其临床特征未被广泛认知，往往无法得到满意的妊娠结局。因此本研究旨在系统全面的描述AZP患者的胚胎学特征，并通过多组学技术探究其发病机制，为之后的临床诊断及针对性治疗提供可靠依据。 方法： (1)收集2015年05月至2020年10月本中心的患者病例。其中透明带为琼脂样的患者58名共68个取卵周期，设为AZP组。对照组为透明带正常的患者，3866名共4156个取卵周期。 (2)收集2020年10月至2022年10月本中心AZP患者及同期对照患者的各项临床标本，包括粪便、外周血、血清、卵泡液、未成熟卵母细胞及废弃胚胎。 (3)电镜下比较两组患者的卵母细胞及卵丘细胞的超微结构； (4)对AZP患者的外周血进行外显子测序，明确是否存在透明带基因异常； (5)粪便样本的16sRNA测序对两组的肠道菌群进行多样性分析； (6)对两组的卵丘细胞行转录组分析； (7)对两组卵母细胞进行单细胞RNA测序分析； (8)ELISA试剂盒检测两组卵泡液及血清中活性Transforminggrowthfactorβ1(TGF-β1)的含量。 (9)荧光染色检测两组卵母细胞内目标基因的蛋白表达。结果： (1)临床回顾性结果显示：AZP组胚胎发育参数，如卵裂率、优质胚胎率、囊胚率、优质囊胚率均显著低于对照组，并且体式显微镜下观察发现两组卵冠丘复合物结构有明显差异； (2)卵母细胞及卵丘细胞电镜结果发现：AZP组透明带致密紊乱，卵周间隙狭窄，微绒毛减少，且卵丘细胞内线粒体及高尔基体数目均减少，线粒体内嵴模糊； (3)外显子测序结果显示均无透明带相关基因异常； (4)肠道微生物结果显示：AZP组拟杆菌门、肠杆菌属和丹毒梭菌属的丰度显著高于对照组; (5)卵泡液代谢物分析：两组存在36个差异代谢物，累及多种细胞功能； (6)颗粒细胞转录组显示：AZP组较对照组在炎症相关免疫反应及细胞外基质胶原蛋白方面存在异常； (7)单细胞测序及共聚焦结果发现：胶原蛋白COL11A1在AZP卵母细胞中的表达明显高于正常卵母细胞，且在AZP中异常积聚； (8)卵泡液及血清中炎症因子检测发现：活性TGF-β1含量在AZP组显著的上升， 且在AZP上异常表达。 结论： （1）AZP的发生损伤卵母细胞发育潜能，ICSI可使部分异常卵母细胞正常受精及发育，并诞生健康后代。此外，OCCCs的独特结构可为AZP卵母细胞的受精策略调整提供直接依据； （2）AZP患者体内存在的慢性炎症可能使血浆中TGF-β1的水平升高，进而导致患者卵泡液中TGF-β1量增多，随后上调卵母细胞内COL11A1的蛋白表达，造成透明带上COL11A1的异常积聚，从而发生透明带琼脂样改变。
NETL