摘要
硝唑尼特（NTZ）作为一种抗寄生虫类药物，却显示抗多种微生物甚至新冠病毒的活性。因此，激发了研究者对NTZ衍生物的研究兴趣。如何利用NTZ的靶标或作用机制，开发更高效、广谱的药物，首要任务是探究NTZ的药物靶标或作用机制。因此，需对NTZ进行结构修饰或改造以期获得能开展亲和层析、荧光靶向定位的衍生物。本研究在实验室已有基础上设计合成了生物素以及荧光标记的NTZ探针并开展系列研究，为研究NTZ的生物机制奠定了理论基础。 为探究NTZ的靶向位置以及靶向蛋白，本研究以NTZ为靶向配体，设计并合成了与罗丹明B相连的荧光探针L-1以及生物素探针B7；随后，以不同细胞和大肠杆菌为研究对象，比较了NTZ与两种探针对体外细胞活力和抗菌活性的影响；在对体外细胞活力探究中发现，与NTZ相比，不同浓度L-1和B7在不同时间作用于不同细胞后活力均无明显差异；抗菌测试观察其是否改变NTZ抗菌活性，结果发现L-1、B7与NTZ都未产生抗大肠杆菌的效果，间接表明对NTZ结构修饰并未改变其活性；进一步通过WesternBlot检测荧光探针L-1和生物素探针B7对自噬标记物LC3B的作用，结果发现B7能显著诱导细胞自噬，与NTZ具有一致的生物学功能。 随后，本研究利用荧光倒置显微镜观察了哺乳动物细胞对L-1、罗丹明B的荧光摄取情况，结果发现：与空白对照相比，其表现出较强的荧光，表明L-1与罗丹明B都可进入细胞。进一步利用DAPI与L-1共染，结果发现L-1并未进入细胞核，根据其在细胞质的分布，初步判定药物作用细胞器围绕细胞核，推测其可能是内质网。而TIZ与L-1竞争时细胞荧光强度明显减少，此结果则表明了TIZ进入细胞后与L-1可能具有相同的靶标而形成竞争关系，从而影响了细胞对L-1的摄取。荧光定位结果表明了NTZ的分子靶标位于细胞质。 为进一步筛选NTZ的药物靶标并与相关靶标方法结果进行相互验证，本研究优化了依赖于靶点稳定性的药物亲和反应实验条件，并初步调取获得二十余种NTZ可能的靶向蛋白，对比分析发现这些蛋白主要集中在高尔基体和内质网，该结果与荧光探针的靶向定位结果一致。 综上，本研究成功合成2个NTZ靶标探针，证明两探针保持了NTZ的相关生物活性，并初步确定NTZ的生物学靶标位于细胞质，为进一步筛选获得NTZ的生物学靶标以及阐明其作用机理奠定了物质与理论基础。
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