摘要
季节周期性暴发的水产动物病毒性疾病长期危害着我国水产养殖业，导致该行业遭受重大的经济损失。一般情况下，水生动物病毒性疾病的暴发都有一定的温度依赖性，当环境水温高于或低于病毒的发病温度范围时，疾病有自然停止或减缓的倾向，但关于温度如何影响水产动物发病的机理尚不明晰，这极大阻碍了水产动物病毒性疾病防治措施的建立。由草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus,GCRV)引起的草鱼出血病(Grass carp hemorrhagic disease,GCHD)是一种典型的温度依赖性疾病，本文以GCHD为研究模型，旨在探究GCRV温度依赖性致病的分子机制，为制定GCHD及其它水产动物温度依赖性病毒病的防治措施提供理论依据。具体研究内容如下: (1)明确GCRV感染草鱼发病的季节周期性及温度依赖性 变温水生动物病毒性疾病与恒温哺乳动物病毒性疾病相比，更容易受温度波动的影响，呈现典型的季节周期性或温度依赖性。本文以GCRV引起的草鱼出血病为研究对象，通过发放调查问卷、实时跟踪草鱼养殖基地GCRV发病情况、设计温度应激宿主后感染病毒、体外GCRV感染宿主细胞后在不同温度间转换等实验，运用荧光定量PCR(qPCR)、免疫印迹(WB)、透射电镜等技术，证实GCRV感染草鱼具有季节周期性和温度依赖性的表型。结果显示，在长沙、益阳等地，GCHD一般在6-9月份为发病高峰期，其中以6月、7月发病最为严重;GCHD发病时，在24℃-28℃时，草鱼死亡率最高，当温度降为20℃以下时，患病草鱼自然康复，未见死亡。在细胞实验中，感染GCRV的细胞在18℃条件下病毒复制几乎停止，当把该细胞从18℃转到28℃时，病毒复制显著上调;同理，在28℃条件下GCRV感染细胞时，病毒正常复制，但把其转移到18℃时，病毒复制几乎停止。结果表明温度严格调控GCHD发病，当环境温度低于发病温度时，GCHD发病可自然停止。 (2)阐明IL6-STAT3-HSP90轴在GCRV温度依赖性感染中的作用 为阐明GCRV感染草鱼具有温度依赖性的生物学机制，我们推测病毒可能利用宿主体内与温度相关的代谢通路或蛋白来提高其感染效率。本章节首先通过热应激宿主细胞转录组联合GCRV感染转录组筛选分析，推断与IL6-STAT3通路相关的细胞因子或蛋白可能介导GCRV的温度依赖性感染。通过GCRV感染、温度应激、抑制剂/激动剂刺激、蛋白孵育、STRING数据库检索、STAT3敲除、转录组分析、质膜分离等实验，运用qPCR、WB、免疫共沉淀（Co-IP）、荧光定位等技术手段,证实IL6-STAT3信号通路在GCRV感染温度依赖性致病机理中的关键作用，并且该通路可以通过调控HSP90的表达影响GCRV感染宿主细胞。进一步利用纯化的病毒外衣壳蛋白VP7进行pulldown、质谱鉴定、Far-Western blotting、免疫荧光、免疫共沉淀等技术手段验证HSP90与VP7互作介导GCRV入胞。以上结果表明，温度可以通过调控IL6-STAT3-HSP90轴的活性，影响GCRV感染草鱼;当草鱼遭遇应激时，可以通过大量表达HSP90辅助GCRV完成入侵过程。 （3）阐明HSP70介导GCRV感染草鱼的温度依赖性 为了解析温度调控GCRV感染草鱼的分子机制，本研究通过多转录组学分析，发现除HSP90外，HSP70在GCRV感染宿主的温度依赖性发病机制中也发挥了重要作用。进一步通过siRNA敲降、过表达、药物抑制、质膜分离等实验证明，在GCRV感染的早期阶段，部分位于细胞膜上的HSP70与VP7相互作用，促进病毒入胞。此外，病毒衣壳蛋白VP7也能与HSP90、HSP70、STAT3、EEA1在内的多个宿主蛋白相互作用，调节整合素、SRB1、LamR等受体基因的表达，同时促进病毒入胞。 本论文揭示了 GCRV免疫逃逸的又一分子机制:GCRV劫持受温度调控的宿主热休克反应相关蛋白促进病毒入胞，这将为草鱼出血病防控策略的研发提供新的思路和理论基础。同时，我们利用其它变温脊椎动物（鲤、大鲵）及其对应的DNA病毒或RNA病毒进行验证，发现这些病毒和宿主在协同进化时也具有类似的作用机制来促进其免疫逃逸。以上这些新发现将为后续开发变温动物病毒性疾病药物提供分子靶点，同时为制定水产动物病毒性疾病的防治措施提供理论基础。
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