摘要
本文主要从以下几个部分展开论述： 第一章:子宫腺肌病局部免疫细胞亚群分析 子宫腺肌病(Adenomyosis,AM)是子宫内膜腺体和间质侵入子宫肌层形成局限或弥漫性的病变，是妇科常见病和疑难病。该病好发于育龄期妇女，主要临床症状包括严重痛经、月经过多和不孕，严重影响患者的身心健康。目前，该病的治疗手段有限，保守治疗还存在诸多争议。子宫腺肌病的发病机制复杂，目前已提出了很多学说，但尚不能完整的解释该病临床特征的异质性。因此，探索子宫腺肌病的具体发病机制对患者的早期识别、早期诊断、早期防治尤为必要。 免疫失调一直被认为是子宫腺肌病的重要发病机制，子宫腺肌病患者子宫局部存在多种免疫细胞数量的异常。然而，以往研究多采用免疫组织化学染色技术来识别不同的免疫细胞亚群，鉴于其定量细胞数目的局限性，既往研究报道的子宫腺肌病免疫细胞改变异质性较高，甚至相互矛盾。目前仍然缺乏对子宫腺肌病患者局部子宫微环境免疫细胞失调的整体客观评价。因此，需要进一步对子宫腺肌病患者局部子宫微环境中免疫细胞改变精细分群鉴定，明确异常亚群及其致病功能表型。 目的: 明确子宫腺肌病患者局部子宫微环境免疫细胞亚群的改变，探究异常免疫细胞亚群与腺肌病患者临床病理特征的相关性，筛选与腺肌病发生发展密切相关的免疫细胞亚群。 方法: 1、应用流式细胞术检测子宫腺肌病患者与对照组子宫肌瘤患者同一类型组织中(在位子宫内膜vs.对照子宫内膜，异位病灶vs.对照子宫肌层)免疫细胞亚群的比例和绝对数目差异。 2、采用相关性分析明确免疫细胞亚群的改变与腺肌病患者临床病理特征的相关性。 结果: 1、流式细胞术结果显示，与对照子宫内膜和子宫肌层相比，腺肌病在位子宫内膜和异位病灶中CD45+总免疫细胞比例和绝对数目均无明显差异，但腺肌病异位病灶CD3+T细胞比例和绝对数目均明显增加。 2、对于T细胞亚群,发现腺肌病异位病灶CD8+T细胞占CD45+总免疫细胞、CD3+T细胞的比例增加，其绝对数目亦显著增加，但CD4+T细胞在不同组别无明显差异，CD4+T/CD8+T细胞的比率在腺肌病异位病灶降低。 3、对于CD8+T细胞亚群，发现子宫组织中CD8+黏膜相关恒定T细胞(CD8+Mucosal-associated invariant T cells,CD8+MAIT)占总 CD8+T 细胞的比例较低，且 CD8+MAIT细胞比例和绝对数目在子宫腺肌病与对照组间无显著差异;而腺肌病异位病灶中CD103+CD8+T细胞比例和绝对数目均较对照子宫肌层显著增多。 4、相关性分析发现，弥漫性子宫腺肌病患者的CD3+T细胞和CD8+T细胞数目明显多于局灶性子宫腺肌病患者。此外，CD3+T和CD8+T细胞数目与弥漫性子宫腺肌病、血清CA125水平呈正相关。 5、除T细胞外，还发现腺肌病异位病灶B细胞比例减少，但数目无统计学差异;腺肌病在位子宫内膜NKT细胞比例和数目均增加;但是，异位病灶中B细胞及在位内膜中NKT细胞数目与临床病理特征间未见显著差异或相关性。 结论: 1、子宫腺肌病局部子宫微环境存在多种免疫细胞亚群失调，其中CD8+T细胞的数量增加是子宫腺肌病患者异位病灶免疫细胞亚群最主要的改变。 2、增多的CD8+T细胞与疾病临床病理特征具有相关性，并具有组织驻留特性，提示CD8+T细胞可能在子宫腺肌病的发病机制中具有潜在的致病作用。 第二章:子宫腺肌病耗竭性NKG2A+CD8+T细胞表型及功能研究 第一章研究发现，腺肌病异位病灶中CD8+T细胞数量增加，并且与疾病的临床病理特征具有相关性，提示CD8+T细胞可能参与腺肌病的发生发展。作为典型的杀伤细胞，CD8+T细胞增多却无法阻止异位子宫内膜细胞在病理部位异常聚集和滞留，具体机制尚不明确。既往研究认为除了细胞数量的改变外，免疫细胞的功能状态也与疾病的发生发展密切相关。然而，CD8+T细胞的功能缺陷是否可能导致异位子宫内膜细胞在病理部位异常聚集和滞留尚不清楚，因此有必要进一步探究CD8+T细胞在腺肌病中的致病表型。在持续暴露于抗原和/或炎症信号下，CD8+T细胞功能会恶化，这被称为T细胞耗竭(T-cell exhaustion)。在T细胞耗竭过程中，CD8+T细胞上调多种负性免疫检查点(Immune checkpoint,IC)分子和下调细胞因子产生。最近，自然杀伤细胞家族蛋白 2A(Natural killer group protein 2A,NKG2A)被鉴定为一种新型 IC 分子，选择性表达在NK和CD8+T细胞上，并与CD94形成异二聚体受体;CD94/NKG2A与其配体HLA-E结合可诱导NK和T细胞耗竭，从而促进肿瘤进展。子宫腺肌病也是一种慢性炎性疾病，存在多种炎性信号的失调。因此，我们怀疑长期的炎症信号失调导致的CD8+T细胞功能耗竭可能与子宫腺肌病的发生发展有关。HLA-E/NKG2A轴的失调是否会导致子宫腺肌病患者的CD8+T细胞耗竭仍需进一步探讨。 目的: 明确腺肌病是否存在耗竭性的NKG2A+CD8+T细胞，探究其与疾病临床病理特征的关系，并探索导致CD8+T细胞耗竭的相关免疫微环境改变。 方法: 1、应用流式细胞术检测CD94/NKG2A在子宫腺肌病患者外周血、在位子宫内膜和异位病灶中NK和T细胞上的表达差异;检测NKG2A在腺肌病与对照组患者子宫组织中CD8+T细胞上的表达差异;分析NKG2A+CD8+T细胞亚群的表型特征和功能。 2、采用相关性分析明确NKG2A+CD8+T细胞比例和数目与腺肌病患者临床病理特征的相关性。 3、应用免疫组织化学检测腺肌病在位子宫内膜、异位病灶和对照子宫内膜组织中HLA-E、IL-15和TGF-β的表达水平。 4、应用流式分选技术从外周血分选CD8+T细胞，使用细胞因子IL-15和TGF-β体外培养，应用流式细胞术检测CD8+T细胞上NKG2A的表达变化。 5、应用免疫荧光技术检测CD8、NKG2A、HLA-E和IL-15在腺肌病异位病灶中的表达及定位。 结果: 1、流式细胞术结果显示,NKG2A与CD94的表达呈正相关。异二聚体CD94/NKG2A在子宫腺肌病组织驻留CD8+T细胞上富集表达。 2、分析NKG2A+CD8+T细胞的数量变化发现，与对照子宫内膜和子宫肌层相比,该细胞亚群在腺肌病在位子宫内膜和异位病灶中的比例和绝对数目均明显增加。 3、分析其表型特征和功能发现，NKG2A+CD8+T细胞表达负性检查点分子PD-1、LAG-3、TIM-3和耗竭关键调节因子TOX明显升高，但产生穿孔素(Perforin)、颗粒酶B(Granzyme B)和 CD107a 的能力下降。 4、相关性分析结果显示，弥漫性子宫腺肌病患者NKG2A+CD8+T细胞的比例和数目明显多于局灶性子宫腺肌病患者。此外，NKG2A+CD8+T细胞的比例和数目与弥漫性子宫腺肌病、血清CA125水平呈正相关。 5、免疫组化结果显示，与对照子宫内膜相比，HLA-E、IL-15和TGF-β在子宫腺肌病患者的在位子宫内膜和异位病灶中表达显著增加。并且，HLA-E、IL-15和TGF-β在异位病灶中的表达水平高于其配对的在位子宫内膜。 6、体外培养结果显示，外源性rhIL-15显著上调了 CD8+T细胞上NKG2A的表达,而rhTGF-β治疗没有明显改变NKG2A的表达。 7、多重免疫荧光染色发现，异位病灶的腺上皮细胞共表达IL-15和HLA-E,NKG2A+CD8+T细胞紧密分布在共表达IL-15和HLA-E的异位腺体周围。 结论: 1、NKG2A主要表达在子宫腺肌病组织驻留CD8+T细胞上，异位病灶CD8+T细胞表达NKG2A增多，且与疾病临床病理特征具有相关性，提示NKG2A+CD8+T细胞可能参与子宫腺肌病的发生发展。 2、子宫腺肌病异位病灶NKG2A+CD8+T功能耗竭，可能是导致浸润到子宫肌层内的内膜细胞无法被清除的原因。 3、子宫腺肌病微环境中腺上皮细胞IL-15和HLA-E的表达增加，可能通过促进NKG2A在CD8+T细胞上的表达或抑制CD8+T细胞的效应功能，从而导致CD8+T细胞耗竭。
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