摘要
ε-聚赖氨酸（ε-poly-L-lysine，ε-PL）是一种含有25-35个L-赖氨酸单体的多肽聚合体。它具有抑菌性强、抑菌谱广、水溶性强、热稳定性好、生物可降解性和安全性高等优点。ε-PL可以与食品同时进行热加工处理，被多国批准作为食品防腐剂应用于食品保鲜。我国的ε-PL行业起步较晚，ε-PL产量不高，限制了ε-PL防腐剂的发展，因此提高ε-PL产生菌的产量是当前的研究热点。 本研究以ε-PL生产菌株小白链霉菌CICC11022（StreptomycesalbulusCICC11022）为出发菌株，利用抗生素和低pH作为环境压力进行适应性进化实验，成功得到一株高产ε-PL的菌株S.albulusC214；随后，通过对高产菌进行基因组重测序和非靶向代谢组学来分析其突变基因和胞内差异代谢物，初步探究S.albulusC214耐药性、耐酸性和高产ε-PL的机理；最后，进一步通过共培养技术，筛选出枯草芽孢杆菌168（Bacillussubtilis168）能够在共培养体系中促进S.albulusC214的ε-PL产量再次提高。本研究主要内容如下： 1．对S.albulusCICC11022连续施加多重的抗生素和低pH压力，使其产生适应性进化，经过多次筛选得到一株高产ε-PL的菌株S.albulusC214，该菌株的摇瓶发酵产量为1.57g/L，和S.albulusCICC11022（0.62g/L）相比产量提高153.23%；经6次传代培养后，ε-PL产量依然维持在1.57±0.01g/L；考察出发菌株和高产菌株的发酵动力学参数，发现在同等培养条件下，高产菌S.albulusC214的生长和生产性能相比于原始菌均显著增强。 2．在基因和代谢水平上，以S.albulusCICC11022为对照，对S.albulusC214分别进行基因组重测序和胞内差异代谢物检测，并对关键突变基因和差异代谢物进行分析。结果表明，与氨基酸代谢、能量代谢、分子转录调控以及细胞膜功能等方面相关的基因和代谢物中均存在显著差异且具有明显的正向突变性。初步确定S.albulusC214具有更强的调控机制，能使它在抗生素和低pH压力中存活并产生大量活性次生代谢产物ε-PL。 3．在小白链霉菌的ε-PL合成和抗性响应方面有新的研究发现。本研究发现，S.albulusC214细胞内存在编码丝氨酸水解酶、L-抗生素脱水酶以及霉菌酸合成酶的基因，且均发生正向突变。其中编码丝氨酸水解酶和L-抗生素脱水酶的基因可能对ε-PL的聚合度以及空间构造起到重要作用，这在L-赖氨酸聚合为ε-PL的机理中首次被提及，此发现对ε-PL合成机理的研究具有一定的意义。编码霉菌酸合成酶的基因对细胞抵抗抗生素胁迫具有作用，且此前只在分枝杆菌、棒状杆菌以及诺卡菌中存在，这是该基因在链霉菌中首次被发现。 4．利用共培养技术，将可能具有共培养特性的54株菌分别与高产菌S.albulusC214进行共培养初筛，得到了9株表现较好的初筛菌。对初筛菌再次进行在不同梯度接种量下的复筛实验，发现酿酒酵母FD7-1（SaccharomycescerevisiaeFD7-1）和B.subtilis168对S.albulusC214生产ε-PL的能力有稳定的促进作用。经过最终筛选，确定B.subtilis168作为共生菌与S.albulusC214进行共培养实验。对共培养的条件进行优化，摇瓶发酵96h后，S.albulusC214的ε-PL产量为3.30g/L，相比于纯培养（2.47g/L）提高33.60%。该研究证明了共培养技术对促进小白链霉菌产ε-PL具有可行性，这也是首次利用共培养技术提高小白链霉菌ε-PL产量的研究。
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