摘要
断奶期是养猪生产过程中最关键的阶段，该阶段的健康状况将直接影响生猪的整个生长过程和养猪业的经济效益。然而早期断奶容易导致仔猪肠道屏障功能受损，进而导致生长性能下降和腹泻率提高。近年来的研究发现，槲皮素具有提高生长性能、降低腹泻率的作用。本文旨在研究槲皮素对断奶仔猪肠上皮屏障功能损伤中的修复作用，并解析其发挥作用的信号通路。通过动物试验利用腹腔注射（LPS）诱导建立断奶仔猪的肠道屏障功能损伤模型，并通过日粮添加槲皮素研究其对断奶仔猪肠道上皮屏障功能的保护作用以及对PKCα/MLCK信号通路的影响;在此基础上通过TNF-α诱导IPEC-J2细胞建立肠上皮细胞屏障损伤模型，研究槲皮素保护肠上皮屏障的作用机制，并利用通路阻断剂及激动剂，抑制或激动PKCα激酶或MLCK激酶，检测两者对应的通路蛋白的表达变化以及对肠上皮紧密连接结构的影响，探究两者之间的协同作用，阐明槲皮素通过PKCα/MLCK/MLC信号通路来介导紧密连接结构，从而保护肠道上皮屏障功能。为利用槲皮素来保护仔猪肠道健康的研究提供理论依据，为营养调控仔猪断奶应激开辟一条新思路。主要研究结果如下: 1.槲皮素对免疫应激仔猪肠道屏障功能的影响 本试验选取体重相近、胎次相同的21日龄健康“杜×长×大”三元杂交断奶仔猪48头，随机分为6组，每组8栏，每栏1头猪，即对照组（饲喂基础日粮）、0.02％槲皮素组（基础日粮中添加200mg/kg槲皮素）、0.04％槲皮素组（基础日粮中添加400mg/kg槲皮素）、LPS组（饲喂基础日粮，腹腔注射LPS）、LPS+0.02％槲皮素组（基础日粮中添加200mg/kg槲皮素，注射LPS）和LPS+0.04％槲皮素组（基础日粮中添加400mg/kg槲皮素，注射LPS）。试验为期19天。在试验的第19天清晨，给LPS组仔猪腹腔注射100μg/kgBW的LPS,对照组和槲皮素组则注射等量的生理盐水，4h后屠宰，取样后检测。 试验结果表明，1）LPS刺激显著降低了空肠绒毛高度和绒毛高度与隐窝深度的比值以及回肠的绒毛高度与隐窝深度的比值（P＜0.05）,使肠道微绒毛数量减少，排列杂乱，紧密连接结构受损。日粮添加槲皮素显著增加了空肠的绒毛高度、绒毛高度和隐窝深度的比值及回肠绒毛高度和隐窝深度的比值（P＜0.05）,肠道微绒毛整齐有序，长度增加，紧密连接结构清晰。2）LPS刺激显著提高了血清中二胺氧化酶活性、D-乳酸和内毒素水平(P＜0.05),日粮添加槲皮素则显著降低了血清中内毒素水平(P＜0.05)。3)LPS刺激显著增加了空肠和回肠组织中IFN-γ、TNF-α的mRNA表达量(P＜0.05),日粮添加槲皮素则显著降低了空肠和回肠组织中IFN-γ、TNF-α的mRNA表达量(P＜0.05)。4)LPS刺激显著降低了空肠和回肠组织中紧密连接蛋白的mRNA表达量与蛋白的表达与分布(P＜0.05),日粮添加槲皮素则显著增强了空肠和回肠组织中紧密连接蛋白的mRNA表达量与蛋白的表达与分布(P＜0.05)。以上结果表明，腹腔注射LPS成功构建了肠道屏障功能损伤模型，日粮中添加槲皮素能改善肠道形态与屏障功能，并降低炎症因子的表达，提高紧密连接蛋白的表达，从而抵御LPS对肠道屏障功能的损伤。 2.槲皮素对免疫应激仔猪肠道PKCα/MLCK信号通路的影响 在上述实验的基础上，分析日粮添加槲皮素对免疫应激仔猪肠道PKC酶活性及PKCα/MLCK信号通路相关蛋白(PKCα、p-PKC、MLCK和p-MLC)表达丰度的影响。 试验结果表明:1)LPS刺激显著提高了空肠和回肠组织中的PKC蛋白激酶活性(P＜0.05),而日粮添加槲皮素则显著降低空肠和回肠组织中的PKC蛋白激酶活性(P＜0.05)。2)LPS刺激显著提高了空肠和回肠组织中的PKCα蛋白表达及其磷酸化水平、MLCK蛋白表达和MLC蛋白磷酸化水平(P＜0.05),而日粮添加槲皮素则显著降低了空肠和回肠组织中的PKCα蛋白表达及其磷酸化水平、MLCK蛋白表达和MLC蛋白磷酸化水平(P＜0.05)。以上结果表明，LPS构建的肠道屏障功能损伤模型激活了PKCα和MLCK蛋白激酶的相关信号通路，而日粮添加槲皮素则成功抑制了PKCα和MLCK蛋白激酶的激活，由此可见，槲皮素可能通过抑制PKCα/MLCK信号通路来调控紧密连接蛋白。 3.PKCα/MLCK信号通路在槲皮素缓解肠道屏障功能损伤中的作用 本试验采用Transwell细胞培养体系，利用新生仔猪空肠上皮细胞IPEC-J2具有的猪小肠上皮细胞特性来构建单层细胞模拟仔猪肠道屏障模型，采用TNF-α作为诱导剂，构建猪的肠道上皮细胞IPEC-J2屏障功能损伤模型。试验首先通过槲皮素30μmol/L预处理24h,TNF-α50μg/mL损伤处理12h后收集样品后检测，研究槲皮素对细胞活力、TEER、紧密连接蛋白影响，通过MLCK抑制剂(ML-7;300nM;预处理2h)、PKCα激酶的激动剂剂(PMA;20nM;预处理2h)以及PKCα激酶的抑制剂(Rottlerin;30μM;预处理2h、Ro31-8220;20nM;预处理2h）来研究PKCα以及MLCK信号通路的影响。 试验结果表明:1）槲皮素处理IPEC-J2细胞能够显著增加其细胞活力（P＜0.05）。2）经过Transwell进行细胞培养13天后，构建了跨上皮电阻稳定的单层IPEC-J2细胞，与对照组相比，槲皮素预处理显著的增加了细胞的跨上皮电阻TER（P＜0.05）,经过TNF-α损伤处理后细胞的跨上皮电阻呈下降趋势，在处理结束后的第四天显著降低（P＜0.05）。而槲皮素预处理缓解了由TNF-α诱导的单层IPEC-J2细胞的跨上皮电阻的下降，并在槲皮素处理结束后第三天，与TNF-α组相比，显著增加了细胞的跨上皮电阻（P＜0.05）。3）TNF-α诱导显著降低IPEC-J2细胞的紧密连接蛋白的表达（P＜0.05）。而槲皮素预处理缓解了由TNF-α诱导的IPEC-J2细胞的紧密连接蛋白的损伤，与TNF-α组相比，显著增加了紧密连接蛋白的表达（P＜0.05）。同时，与对照组相比，槲皮素处理组的紧密连接蛋白的分布由细胞质向细胞骨架增加。4）与对照组相比，TNF-α单独处理显著降低了紧密连接蛋白的表达（P＜0.05）,并显著增加了MLC的磷酸化（P＜0.05）。同时，与TNF-α组相比，在槲皮素与ML-7预处理后均显著增加了紧密连接蛋白的mRNA表达量及蛋白表达量（P＜0.05）,并显著降低了MLCK的蛋白表达及MLC蛋白的磷酸化水平（P＜0.05）。5）与对照组相比，槲皮素处理组显著降低了PKCα激酶的表达量及磷酸化水平（P＜0.05）,并显著降低了PKC激酶的酶活性（P＜0.05）。而TNF-α组对PKCα激酶的表达量及磷酸化水平以及PKC激酶的酶活性没有显著影响。而PMA预处理后，槲皮素再处理显著降低了PKCα激酶的表达量及磷酸化水平（P＜0.05）,并显著降低了PKC激酶的酶活性（P＜0.05）。同时，与TNF-α组相比，Rottlerin、Ro31-8220和槲皮素分别进行的预处理都显著抑制了PKCα激酶的表达量及磷酸化（P＜0.05）,也显著降低了PKC激酶的酶活性以及MLCK的蛋白表达及MLC蛋白的磷酸化水平（P＜0.05）。以上的试验结果表明，槲皮素缓解了TNF-α诱导的肠上皮屏障功能损伤，并通过抑制PKCα的激活来抑制TNF-α诱导的MLCK的激活，从而调控紧密连接蛋白，缓解肠上皮屏障功能损伤。 综上所述，日粮中添加槲皮素可降低肠道通透性，并缓解肠道屏障功能损伤，该功能的发挥是通过抑制PKCα/MLCK信号通路介导紧密连接蛋白来实现的。
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