摘要
目的: 明确电针内关治疗心肌缺血再灌注(Ischemia/Reperfusion,I/R)损伤效应，从“外泌体”这一全新视角入手研究电针内关对心肌I/R损伤模型大鼠血清外泌体微小核糖核酸(MicroRNA,miRNA)表达的影响，并筛选效应相关关键miRNA分子，分析靶基因和信号通路，为深入探讨电针内关治疗心肌I/R损伤物质基础和作用机制提供参考，并为进一步运用现代生物技术促进针灸理论和转化研究提供新方向。 方法: 1.40只健康雄性SD大鼠随机分为假手术组10只和心肌I/R损伤模型组30只,心肌I/R损伤模型组采用冠状动脉结扎法复制心肌I/R损伤大鼠模型，造模成功后随机分为模型组、电针非经非穴组和电针内关组每组各10只，假手术组不结扎冠脉。电针非经非穴组选择双侧“非经非穴点”，电针内关组选取双侧“内关”，均进行电针治疗7天，假手术组和模型组不进行治疗。 2.干预7天后，采用动物彩色超声影像系统测算左室射血分数(leftventricularejectionfraction,LVEF)和左室短轴缩短率(Leftventricularfractionshortening,LVFS)比较各组大鼠的心功能状况;采用酶联免疫吸附法(EnzymelinkedimmunosorbentAssay,ELISA)测定血清乳酸脱氢酶(Lactatedehydrogenase,LDH)、肌酸激酶(Creatinekinase,CK)、同工酶(Creatinekinase-MB,CK-MB)和肌红蛋白(Myoglobin,MB)水平评价各组大鼠心肌酶情况，同样方法检测心肌组织白细胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)、白细胞介素-18(Interleukin-18,IL-18)、肿瘤坏死因子-α(Tumornecrosisfactor-α,TNF-α)和单核细胞趋化蛋白-1(Monocytechemoat-tractantprotein-1,MCP-1)水平评价各组大鼠心肌炎症反应情况;采用苏木精-伊红染色法(Hematoxylin-eosinstaining,HE)镜下观察各组大鼠心肌组织病理形态损伤情况;同时通过TUNEL荧光染色法镜下观察心肌凋亡情况，计算比较各组大鼠心肌细胞凋亡率。 3.干预7天后，每组选取3只大鼠采用血清超速离心法分离提取血清外泌体，并应用透射电镜和纳米流式检测技术进行外泌体形态、浓度径粒和表面标志蛋白检测鉴定。应用smallRNA测序技术对各组大鼠血清外泌体中的miRNA进行测序，并筛选差异表达miRNA。组间比较筛选层次如下:(1)比较模型组与假手术组血清外泌体miRNA表达情况;(2)比较电针非经非穴组与模型组血清外泌体miRNA的表达情况;(3)比较电针内关组与模型组血清外泌体miRNA的表达差异。基于上述3个比较层次，运用韦恩图筛选出电针内关治疗心肌I/R损伤关键血清外泌体miRNA。 4.选用Targetscan和miRDB对筛选出的电针内关治疗心肌I/R损伤关键血清外泌体miRNA进行靶基因预测，并进一步分析靶基因的功能及相关通路，分析电针内关通过血清外泌体miRNA治疗心肌I/R损伤可能调控机制。 结果: 1.电针内关治疗心肌缺血再灌注损伤大鼠效应研究结果: (1)超声心动图结果:与假手术组相比，模型组、电针非经非穴组和电针内关组LVEF和LVFS均呈现明显降低(P＜0.05);与模型组相比，电针内关组的LVEF和LVFS显著升高(P＜0.01);与电针非经非穴组相比，电针内关组的LVEF和LVFS显著升高(P＜0.01)。 (2)心肌酶检测结果:与假手术组相比，模型组血清LDH、CK、CK-MB和MB均显著升高(P＜0.001)。与模型组相比，电针内关组血清LDH、CK、CK-MB和MB均显著降低(P＜0.01);电针非经非穴组血清CK水平显著降低(P＜0.01)。与电针非经非穴组相比，电针内关组血清CK呈现显著下降(P＜0.01)。 (3)心肌组织炎症因子结果:与假手术组比较，模型组心肌组织炎症因子IL-6、IL-18、TNF-α和MCP-1水平显著升高(P＜0.05)。与模型组相比，电针内关组在降低心肌组织炎症因子IL-6、TNF-α和MCP-1水平方面具有显著性(P＜0.05);电针非经非穴组心肌组织炎症因子TNF-α和MCP-1也呈现显著降低(P＜0.05)。与电针非经非穴组相比，电针内关组心肌组织炎症因子IL-6显著降低(P＜0.05)。 (4)心肌组织HE染色观察结果:假手术组:心肌组织肌纤维排列整齐，细胞结构清晰完整，细胞核居中，无炎性细胞浸润，无出血、坏死和水肿断裂。模型组:心肌组织肌纤维肿胀、排列紊乱，甚至断裂，细胞结构破坏，间质可见大量炎性细胞浸润，有出血、坏死区。电针非经非穴组:心肌组织肌纤维水肿稍轻、排列相对较整齐，存在部分断裂，心肌细胞结构不完整，间质有较多炎性细胞浸润。电针内关组:心肌组织肌纤维排列基本整齐，细胞水肿程度较轻，结构较完整，少许炎性细胞浸润，病理损伤程度明较轻。 （5）TUNEL荧光染色心肌细胞凋亡率结果:与假手术组相比，模型组心肌细胞凋亡率显著升高（P＜0.05）。与模型组相比，电针非经非穴组和电针内关组心肌凋亡率均有显著降低（P＜0.05）。 2.电针内关对心肌缺血再灌注损伤大鼠血清外泌体miRNA表达和作用靶点通路研究结果: （1）大鼠血清外泌体鉴定分析结果: 通过透射电镜与纳米流式检测技术测定大鼠血清外泌体形态、浓度粒径和表面标志蛋白，证明四组血清外泌体大小、浓度和平均粒径不一致，粒径大小范围均在40-150nm之间，均呈现典型杯托状微型囊体结构，特异性标志物CD9和CD81蛋白表达呈现显著表达。表明本实验各组均已经提取到相对较高质量的大鼠血清外泌体。 （2）大鼠血清外泌体miRNA表达组间对比分析结果: ①模型组与假手术组比较:模型组中有41个miRNA差异表达;在这41个miRNA中，15个miRNA上调，26个miRNA下调。 ②电针非经非穴组与模型组比较:与模型组相比，电针非经非穴组中有4个miRNA差异表达;在这4个miRNA中，3个miRNA上调，1个miRNA下调。 ③电针内关组与模型组比较:与模型组相比，电针内关组中有11个miRNA差异表达;在这11个miRNA中，7个miRNA上调，4个miRNA下调。 （3）电针内关治疗心肌缺血再灌注损伤大鼠血清外泌体关键miRNA筛选和生物信息分析 ①基于上述3个比较层次，经过韦恩图比较筛选，最终得到电针内关治疗心肌I/R损伤关键性的4个关键性血清外泌体miRNA分别为miR-1843b-5p、miR-186-5p、miR-351-3p和miR-22-3p。 ②靶基因预测分析结果:4个关键性miRNA共预测到明确命名靶基因3616个。 ③靶基因GO功能分析结果:4个关键性miRNA共富集到14744项GO功能条目，细胞组成集中在膜结合细胞器、细胞内和细胞内膜结合细胞器等;分子功能主要有蛋白质结合、结合和离子结合等;生物过程主要通过局部化、组织细胞组成和生物过程的正向调节等。 ④靶基因KEGGPathway分析结果:4个关键性miRNA共预测到331条信号通路，主要包括:胞吞作用、肌动蛋白细胞骨架调节、mTOR信号通路、MAPK信号通路、癌症信号通路、癌症胆碱代谢、Hippo信号通路、细胞间隙连接、黑色素生成、癌症miRNAs、长期抑郁症、粘蛋白型O-聚糖生物合成和铁死亡等。 结论: 1.电针内关能显著改善心肌I/R损伤大鼠心功能、降低心肌损害标志物水平、减轻受损心肌炎症、心肌病理损伤和细胞凋亡。 2.miR-1843b-5p,miR-186-5p、miR-351-3p和miR-22-3p是电针内关治疗心肌I/R损伤效应相关关键血清外泌体miRNA。 3.电针内关可能通过血清外泌体miRNA影响mTOR信号通路、MAPK信号通路、Hippo信号通路和铁死亡等发挥治疗心肌I/R损伤作用。
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