摘要
二元胺作为生产工程塑料——尼龙的重要单体，目前主要通过石油基化学合成法生产，存在反应条件严苛、对设备和操作要求高、副产物多等问题。随着资源枯竭、气候变化以及碳中和的提出，开发二元胺生物转化途径已成为实现经济和环境可持续发展的首选方案。本文以大肠杆菌为宿主，构建了生产1,4-丁二胺和1,6-己二胺等中链二元胺的工程菌株。通过工程化改造提高诱导型精氨酸脱羧酶的中性pH适应性、内源合成途径强化、降解代谢流阻断以及发酵优化等策略，实现1,4-丁二胺在大肠杆菌中的高效合成。同时，通过在大肠杆菌中异源构建1,6-己二胺合成途径、结合酶元件适配性组装和辅因子调控等策略提高1,6-己二胺产量，基于体外酶级联催化解析1,6-己二胺合成机制，确定1,6-己二胺合成代谢流节点，并将1,6-己二胺合成途径应用于C7-C10二元胺合成，实现中链二元胺在大肠杆菌中的有效制备。 (1)诱导型精氨酸脱羧酶AdiA的中性pH适应性改造。AdiA具有明显的中性pH抑制效应，限制了其工业化应用。本文通过在AdiA五元环相互作用界面的酸性氨基酸富集区域引入碱性氨基酸突变，获得E445K突变体解除了界面处的静电排斥作用，将AdiA中性pH下的酶活提高了3.2倍。然后，通过在底物通道入口引入酸性氨基酸，提高AdiA对碱性底物的亲和力，获得H736E突变体也将AdiA中性pH下的酶活提高了3倍。进而构建组合突变体E467K_H736E(AdiA-M2)，其kcat值较野生型提高了4.8倍，说明AdiA的底物周转能力明显增强。此外，CadA也存在中性pH活性抑制，利用上述酸碱氨基酸调控突变策略改造CadA，组合突变体E445K_T691D(CadA-M2)在中性pH下的酶活较野生型提高了2.16倍，证明该突变策略具有在这类型脱羧酶的中性pH适应性改造中推广应用的能力。 (2)1,4-丁二胺在大肠杆菌中的高效合成。在大肠杆菌BL21(DE3)中，同时过表达speA、speB和adiA基因强化1,4-丁二胺ADC合成途径，获得1,4-丁二胺生产菌株PUT3。然后，敲除宿主菌中speE，speG，puuA和puuP基因(ΔEGAP)阻断1,4-丁二胺的降解，ΔEGAPPUT3菌株中的1,4-丁二胺产量提高了30%，并将AdiA-M2突变体应用至1,4-丁二胺的合成中，构建PUT6工程菌株，PUT6利用精氨酸合成1,4-丁二胺摩尔转化率提高至0.99mol·mol?1，实现了1,4-丁二胺的高效生产。最终，通过优化初始精氨酸添加浓度、Mg2+浓度和Mn2+浓度，当添加230mmol·L?1初始精氨酸、2mmol·L?1Mg2+和1.5mmol·L?1Mn2+时，PUT6菌株经分批发酵合成了217.3mmol·L?1(~19.1g·L?1)1,4-丁二胺。在补料分批发酵中，1,4-丁二胺产量达到586mmol·L?1(~51g·L?1)，是分批发酵的2.67倍，其摩尔转化率达到0.97mol·mol?1，为生物基丁二胺的工业化奠定了基础。 (3)在大肠杆菌BL21(DE3)中构建1,6-己二胺生物合成途径。首先利用羧酸还原酶MABCAR和转氨酶CVTA在大肠杆菌中成功构建了1,6-己二胺合成途径，实现了1,6-己二胺的全细胞生物合成(0.42mg·L?1)。然后进行转氨酶同工酶优化及其适配性组装模块设计，在含MABCAR-PatA-GabT级联模块的工程菌株DAH10中，1,6-己二胺产量提高至22mg·L?1。通过CAR-CAR-TA-TA级联模块优化和表达强度适配性调节，在含MSMCAR-MABCAR-PatA-SPTA级联模块的DAH86菌株中，1,6-己二胺产量提高至53.11mg·L?1。通过敲除sthA基因调节辅因子NADPH代谢平衡，最终ΔsthA-DAH86能转化6g·L?1己二酸合成238.5mg·L?11,6-己二胺。 (4)1,6-己二胺人工途径合成机制解析及其在中链二元胺合成中的应用。通过分析羧酸还原酶和转氨酶的酶活，确定6-氨基己酸的羧酸还原是1,6-己二胺合成途径的限速步骤之一。结合体外酶级联催化，发现己二酸到己二醛的转化和己二醛到1,6-己二胺的转化能成功实现，而6-氨基己酸至1,6-己二胺的转化无法完成，证实体内1,6-己二胺的合成主要依赖于己二醛支路。通过对比引入外源1,6-己二胺合成途径前后发酵液的代谢成份，发现1,6-己二胺外源途径的引入会导致菌株积累大量的中长链脂肪醇、醛和酯，其中包含254mg·L?1的1,6-己二醇，确定其为1,6-己二胺合成的主要代谢副产物之一。最终，利用1,6-己二胺人工途径成功合成了1,7-庚二胺(21.89mg·L?1)、1,8-辛二胺(0.67mg·L?1)、1,9-壬二胺(9.34mg·L?1)和1,10-癸二胺(18.81mg·L?1)，为中链二元胺的生物合成途经开发提供了一个可行的方向。
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