摘要
ε-聚赖氨酸（ε-poly-L-lysine，简写ε-PL）通常是由25-35个L-赖氨酸聚合而成的同型氨基酸聚合物，对细菌、酵母和真菌等具有广谱抑菌活性，是世界范围内认可的三大微生物源天然食品防腐剂之一。此外，?-PL还被用于食疗剂、干扰剂、酶保护剂、药物载体等领域，具有广泛应用价值。目前，微生物发酵法是工业化生产ε-PL的通用方法。因此，选育ε-PL高产菌株是实现其高效率、低成本生物制造的根本。长期以来，传统诱变技术是改造ε-PL生产菌株的主要方法，尽管实现了其生产性能显著提升，但进一步提高却陷入瓶颈。近年来，随着代谢工程和合成生物技术发展，它们成为改造ε-PL生产菌株的有效方法。然而，目前关于ε-PL生物合成的关键代谢节点和调控机制仍不清楚。 论文以一株基于诱变育种获得的ε-PL高产突变株S.albulusWG608为研究对象，借助转录组学和蛋白质组学研究手段，揭示S.albulusWG608高产机制并发掘ε-PL生物合成的关键代谢途径和关键基因/蛋白。在此基础上，利用基因过表达策略，考察强化ATP合成、增强乙醛酸途径和提高ε-PL合成酶表达量对S.albulusWG608合成ε-PL的影响。主要研究结果如下： （1）基于转录组学与蛋白质组学联合分析，解析了S.albulusWG608高产ε-PL的机制。相比于出发菌株S.albulusM-Z18，突变株S.albulusWG608的糖酵解途径（glk、fbaA）、磷酸戊糖途径（pgl）和乙醛酸循环途径（aceA、sdhA）以及L-赖氨酸合成途径（aspB、、pls）的大多数基因均显著上调，为ε-PL合成前体L-赖氨酸的生物合成提供了足够的还原力和草酰乙酸；氧化磷酸化途径（ATPeF0S、ATPeAF1）相关基因也显著上调，为ε-PL生物合成提供了大量的ATP。此外，脂肪酸、支链氨基酸和其他次级代谢物合成途径的基因均显著下调，为ε-PL生物合成节约了更多的能量和前体。因此，前体L-赖氨酸合成能力增强、ATP供给充足和支路代谢弱化是突变株S.albulusWG608高效积累ε-PL的主要机制。 （2）构建PPK介导的ATP再生系统，提高S.albulusWG608的ε-PL合成能力。通过体外实验，考察了三种不同来源PPK的催化效率和对底物polyPn的偏好性；随后，选择pap（来自约氏不动杆菌）和ppk2Bcg（来自谷氨酸棒杆菌）在S.albulusWG608中进行串联表达得到PL05菌株，构建了从AMP到ADP再到ATP的再生系统。在摇瓶发酵条件下PL05菌株ε-PL产量达到2.30g·L-1，较出发菌株S.albulusWG608提高了21.05%，细胞内ATP含量也增加了71.22%。最后，在分批发酵和补料分批发酵条件下，对polyP6添加条件进行了系统优化，实现重组菌株PL05在5L发酵罐中ε-PL产量达到59.25g·L-1，较S.albulusWG608提高了33.66%，证明了提高ATP的供应量可以促进ε-PL的合成。 （3）同时强化乙醛酸循环和ATP供应及ε-PL合成酶表达量，进一步提高S.albulusWG608的ε-PL合成能力。在S.albulusWG608中分别过表达aceA、sdhA得到PL07以及PL08菌株，在补料分批发酵条件下ε-PL产量分别达到52.34g·L-1以及51.50g·L-1，较S.albulusWG608分别提高了12.70%以及10.90%，表明强化乙醛酸循环可以促进ε-PL的合成。随后，为了提高前体赖氨酸的合成效率，在S.albulusWG608中异源表达ddhcg（来自谷氨酸棒杆菌）以及ddhbs（来自球形芽孢杆菌），得到PL09以及PL10菌株，在补料分批发酵条件下ε-PL产量分别达到52.60g·L-1以及50.24g·L-1，较S.albulusWG608分别提高了14.04%以及8.18%，表明ddhcg相比于ddhbs更适合用于促进ε-PL的合成。最后，在S.albulusWG608中串联表达aceA、sdhA、ddhcg、pap、ppk2Bcg以及pls，得到PL11菌株。在补料分批发酵条件下，PL11菌株的ε-PL产量达到了62.68g·L-1，相比于S.albulusWG608提高了41.39%。
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