摘要
目的 本研究采用“2%高脂饲料+慢性不可预见性温和应激（Chronicunpredictabilitymildstress,CUMS）+孤养”方法建立胆囊胆固醇结石（Cholesterolgallstone,CS）肝郁气滞证动物模型，并予柴胡疏肝散进行干预，从胆囊SCF/C-kit信号通路异常抑制胆囊收缩功能的角度探讨CS肝郁气滞证的分子生物学机制，为CS肝郁气滞证的基础研究提供新的切入点。 方法 1.采用2%高脂饲料诱发法复制CS动物模型。48只5周龄SPF级ICR雄性小鼠按照体质量随机分组分区法分为空白组（12只）和造模组（36只）。空白组予普通饲料喂养，造模组小鼠予2%高脂饲料建立CS小鼠模型。喂食16周后，两组随机各选3只小鼠取材，查看其胆囊结石情况，判断CS模型是否成功。CS模型成功后，再次按照体质量随机分组分区法将造模组小鼠随机分成CS组、CS肝郁组、柴胡疏肝散组（各11只）。 2.采用“CUMS+孤养”法建立肝郁气滞证动物模型，即“CUMS+孤养”21天建立CS肝郁气滞证小鼠模型。肝郁气滞证造模期间，空白组继续予普通饲料喂养，其余三组小鼠继续予2%高脂饲料喂养，CS肝郁组、柴胡疏肝散组在此基础上，小鼠独笼喂养，并进行21天的CUMS干预以建立CS肝郁气滞证模型。CUMS主要包括禁食禁水12h、夹尾10min、湿垫料24h、倾斜鼠笼45°24h、去除垫料2-5h等，每天随机选择1种刺激，同一种干预方法不可连续使用2天。肝郁气滞证造模前后均需观察、记录各组小鼠一般情况并进行行为学实验。肝郁气滞证造模期间，柴胡疏肝散组予柴胡疏肝散加减灌胃治疗，其余各组则予等量生理盐水灌胃。所有干预结束后，将小鼠取材，采集实验所需的样本。 3.ELISA法检测血清CCK含量及胆汁TC、TBA、PL含量并计算胆固醇饱和指数（CSI）。 4.HE染色法观察胆囊组织形态。 5.免疫荧光法检测胆囊ICC细胞数量。 6.q-PCR与Westernblot法分别检测胆囊SCF、C-kit、CCK-A、PLCmRNA和蛋白表达。 结果 1.一般情况：1~16周期间，各组小鼠饮食饮水正常，好动、喜攀爬，精神佳，大小便正常。于第16周最后一天给小鼠称重，与空白组比较，经2%高脂饲料喂养的CS组、CS肝郁组、柴胡疏肝散组小鼠体质量增长明显（Plt;0.01），且该三组间的体质量无差异（Pgt;0.05）。肝郁气滞证造模期间，CS肝郁组与柴胡疏肝散组小鼠出现体质量减轻、精神萎靡、活动迟缓、喜蜷缩于角落、抓取时无明显抵抗等异常行为，与CS肝郁组比较，柴胡疏肝散组小鼠上述异常行为程度较轻，对刺激反应较CS肝郁组小鼠敏感。肝郁气滞证造模结束后，与CS组比较，CS肝郁组体质量明显下降（Plt;0.01）。与CS肝郁组比较，柴胡疏肝散组体质量增加（Plt;0.05）。 2.行为学实验结果：肝郁气滞证造模前，各组小鼠强迫游泳实验、旷场实验及糖水偏好实验结果均无差异（Pgt;0.05）。肝郁气滞证造模结束后，与CS组比较，CS肝郁组静止不动时间和中格停留时间增加显著（Plt;0.01）、直立次数显著减少（Plt;0.01）、移动总距离明显缩短（Plt;0.01），糖水消耗率显著降低（Plt;0.01）。与CS肝郁组比较，柴胡疏肝散组小鼠静止不动时间和中格停留时间明显减少（Plt;0.01），直立次数明显增加（Plt;0.01）、移动总距离显著延长（Plt;0.01），糖水消耗率明显升高（Plt;0.01）。 3.胆囊结石情况：肝郁气滞证造模结束后，与空白组比较，CS组、CS肝郁组小鼠均出现胆汁褐色浑浊、透光性差，胆囊体积增大，胆囊内可见泥沙样沉淀等异常改变。与CS组小鼠比较，CS肝郁组胆囊体积明显增大，胆汁浑浊程度加深，胆囊内泥沙样沉淀增多、范围更广。相较于CS肝郁组，柴胡疏肝散组小鼠胆汁浑浊程度、透光性有所改善，泥沙样沉淀减少，胆囊体积也有所恢复。 4.血清CCK含量：与空白组比较，CS组、CS肝郁组血清CCK含量显著降低（Plt;0.01）。与CS组比较，CS肝郁组血清CCK含量显著减少（Plt;0.01）。相较于CS肝郁组，柴胡疏肝散组血清CCK含量显著增加（Plt;0.01）。 5.胆汁TC、TBA、PL含量及CSI水平：与空白组比较，CS组、CS肝郁组TC含量显著增加（Plt;0.01），TBA、PL则显著减少（Plt;0.01），两组小鼠胆汁CSI水平均大于1（Plt;0.01）。与CS组比较，CS肝郁组胆汁TC含量显著增加（Plt;0.01），而TBA、PL含量明显降低（Plt;0.01），CS肝郁组胆汁CSI水平明显高于CS组（Plt;0.01）。与CS肝郁组比较，柴胡疏肝散组胆汁TC含量降低（Plt;0.05），TBA、PL含量增加（Plt;0.01，Plt;0.05），柴胡疏肝散组胆汁CSI水平明显低于CS肝郁组（Plt;0.01）。 6.胆囊组织HE染色：空白组胆囊结构完整，胆囊壁厚度正常，皱襞多而分支。CS组、CS肝郁组小鼠胆囊均出现胆囊壁增厚，皱襞缩短、分支减少等病理变化。其中CS肝郁组上述病理改变加重，胆囊壁明显增厚，皱襞矮小增粗、分支少，形态破坏严重。而柴胡疏肝散组小鼠胆囊壁增厚，皱襞缩短、分支减少等病理改变较CS肝郁组明显改善。 7.胆囊ICC细胞数量：与空白组比较，CS组、CS肝郁组胆囊C-kit阳性蛋白表达减弱，胆囊ICC细胞数量显著减少。与CS组比较，CS肝郁组胆囊C-kit阳性蛋白表达明显减弱，胆囊ICC细胞数量明显减少。与CS肝郁组比较，柴胡疏肝散组胆囊C-kit阳性蛋白表达明显增强，胆囊ICC细胞数量明显增多。 8.胆囊SCF、C-kit、CCK-A、PLCmRNA表达量：与空白组比较，CS组、CS肝郁组胆囊SCF、C-kit、CCK-A、PLC的mRNA表达量显著下降（Plt;0.01）。相较于CS组，CS肝郁组SCF、C-kit、CCK-A、PLC的mRNA表达量明显降低（Plt;0.01）。与CS肝郁组比较，柴胡疏肝散组SCF、PLC的mRNA表达量显著增加（Plt;0.01），C-kit、CCK-A的mRNA表达水平升高（Plt;0.05）。 9.胆囊SCF、C-kit、CCK-A、PLC蛋白表达量：与空白组比较，CS组、CS肝郁组胆囊SCF、C-kit、CCK-A、PLC蛋白表达量显著降低（Plt;0.01）。与CS组比较，CS肝郁组SCF、C-kit、CCK-A、PLC蛋白表达量显著降低（Plt;0.01）。与CS肝郁组比较，柴胡疏肝散组SCF、CCK-A、PLC蛋白表达量显著增加（Plt;0.01），胆囊组织C-kit蛋白表达水平明显升高（Plt;0.05）。 结论 1.21天“CUMS+孤养”模拟的慢性应激可明显加重CS模型胆囊结石情况。 2.胆囊SCF/C-kit信号通路上SCF、C-kit因子低水平表达抑制ICC细胞生长，导致胆囊CCK-A及PLC表达异常可能是CS肝郁气滞证的分子生物学机制。 3.柴胡疏肝散加减可改善胆囊SCF、C-kit因子的低水平表达，促进胆囊ICC细胞的生长、发育，增加CCK-A受体表达水平，激活PLC表达，促进胆囊收缩，减轻胆汁淤积程度，发挥疏肝利胆排石作用。
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