摘要
目的: 以佐剂性关节炎模型为载体，以临床艾灸抗炎免疫调节的常用穴位足三里为穴位代表，拟从肥大细胞脱颗粒-树突细胞募集角度深入探讨艾灸后穴位皮肤免疫激活的机制，为艾灸起效的穴位局部始动机制提供科学依据，从而进一步丰富艾灸作用机理。 方法: 1.将C57BL/6J小鼠随机分为空白组、模型组、模型+艾灸组（简称:艾灸组），以完全弗氏佐剂（CFA）于右足底注射诱导佐剂性关节炎（AA）模型。造模后第7天，空白组、模型组仅捆绑，艾灸组于“足三里”穴给干预20min,5天为一个疗程，疗程间休息2天，治疗效应于造模前（Day0）、实验第7、14、21、28天5个时间点测量足容积，于最后一次干预结束后取材检验血清中细胞因子含量及淋巴结、脾脏Treg/Th17比例。 2.将C57BL/6J小鼠随机分为空白组、模型组、艾灸组，于最后一次干预结束后取材检验穴位皮肤TNF-α+、IL-1β+、CD83+表达。 3.将C57BL/6J小鼠随机分为空白组、模型组、艾灸组、模型+生理盐水+艾灸组（简称:NS组）、模型+色甘酸钠+艾灸组（简称:SCG组）。以CFA诱导AA模型。造模后第7天，空白组、模型组仅捆绑，艾灸组于“足三里”穴给干预20min,NS组、SCG组于“足三里”穴皮下注射生理盐水或2％色甘酸钠（SCG）10μl后20min再进行艾灸，5天为一个疗程，疗程间休息2天。治疗效应于实验第7、14、21、28天5个时间点测量足容积，于最后一次干预结束后取材检验血清中细胞因子含量，淋巴结、脾脏Treg/Th17比例及穴位皮肤CD83+表达。 4.将ItgaxEGFP小鼠随机分为空白组、模型组、艾灸组。造模、干预同前。利用双光子活体成像技术观察实验第7、14、21、28天5个时间点艾灸对穴位皮肤CD11c+树突细胞（DC）数量及其形态变化，并在最后一次干预结束后取材检验穴位皮肤CD11c+与CD83+共表达。 5.将ItgaxEGFP小鼠，随机分为空白组、模型组、艾灸组、NS组、SCG组。造模、干预同前。实验第7、14、21、28天5个时间点利用双光子活体成像观察穴位皮肤CD11c+DC数量及形态变化，并在最后一次干预结束后取材，检验穴位皮肤CD11c+与CD83+共表达。 结果: 1.艾灸足三里对AA小鼠抗炎免疫调节的效应研究 ①足容积测量结果:造模一周后较空白组，模型组、艾灸组显著增加（P＜0.01）。从艾灸后一周开始，较模型组，艾灸组明显下降（P＜0.05）。 ②ELISA检验结果:较空白组，模型组、艾灸组血清中TNF-α和IL-1β含量显著增加（P＜0.01）。较模型组,艾灸组血清中TNF-α（P＜0.05）和IL-1β（P＜0.01）含量均降低。而血清中IL-10和IL-17含量模型组与艾灸组无明显差异（P＞0.05）。 ③流式细胞检验结果:较空白组，模型组小鼠淋巴结、脾脏Treg/Th17比例显著下降(P＜0.01）。较模型组，艾灸组小鼠Treg/Th17比例显著升高（P＜0.01）。 2.艾灸足三里对AA小鼠穴位皮肤免疫激活的研究 免疫荧光结果:较空白组，模型组穴位皮肤TNF-α+、IL-1β+表达量增加（P＜0.01）,艾灸组较模型组表达量显著升高（P＜0.01）。较空白组，模型组穴位皮肤CD83+表达量显著增加（P＜0.01）,艾灸组较模型组表达量增加（P＜0.05）。 3.肥大细胞脱颗粒介导艾灸穴位皮肤免疫激活机制研究 ①足容积测结果:造模后，较空白组其余四组足容积明显增大（P＜0.01）。从艾灸后1周开始较模型组，艾灸组开始减小（P＜0.05）。艾灸后2周、艾灸后3周较模型组,艾灸组、NS组显著下降（P＜0.01）,SCG组则无显著差异（P＞0.05)。 ②甲苯胺蓝染色结果:较空白组，模型组MCG比例无明显差异（P＞0.05）。较模型组，艾灸组MCG比例升高（P＜0.05）,NS组显著升高（P＜0.01）,SCG组则无显著差异（P＞0.05）。 ③ELISA检测结果:较空白组，模型组血清TNF-α和IL-1β含量显著增加（P＜0.01）,较模型组，艾灸组、NS组显著增加（P＜0.01）,SCG组则无明显差异（P＞0.05）。 ④流式细胞术检测结果:较空白组，模型组淋巴结Treg/Th17比例显著下降（P＜0.01）。较模型组，艾灸组明显升高（P＜0.05）,NS组显著升高（P＜0.01）,SCG组无显著差异（P＞0.05）。较空白组，模型组脾脏Treg/Th17比例明显下降（P＜0.05）,较模型组，艾灸组明显下降（P＜0.05）,NS组、SCG组无明显差异（P＞0.05）。 ⑤免疫荧光结果:较空白组，模型组穴位皮肤CD83+表达量增加（P＜0.05）。较模型组，艾灸组、NS组增加（P＜0.05）,SCG组无显著差异（P＞0.05）。 4.DC参与艾灸促使穴位皮肤免疫激活的机制研究 ①双光子成像结果:造模前各组穴位皮肤CD11c+DC数量无明显差异（P＞0.05）,造模后较空白组，模型组、艾灸组显著增加（P＜0.01）。从艾灸1周后开始，艾灸组较模型组显著增多（P＜0.01）,艾灸3周后艾灸组较模型组增多（P＜0.05）。 ②免疫荧光结果:较空白组，模型组穴位皮肤CD11c+与CD83+共表达量显著增多（P＜0.01）,艾灸组较模型组显著增多（P＜0.01）。 5.肥大细胞脱颗粒-树突细胞募集介导艾灸穴位皮肤免疫激活机制研究 ①双光子成像结果:造模前五组穴位皮肤CD11c+DC数量无明显差异（P＞0.05）,具有可比性。造模1周后较空白组其余四组显著增多（P＜0.01）。干预1周后艾灸组较模型组增多（P＜0.05）。干预3周后艾灸组（P＜0.01）、NS组（P＜0.05）、SCG组（P＜0.01）较模型组增多。 ②免疫荧光结果:较空白组，模型组穴位皮肤CD11c+与CD83+共表达增加（P＜0.01）。较模型组，艾灸组、NS组较模型组均增加（P＜0.05）。 结论: 1.肥大细胞脱颗粒介导艾灸足三里对AA小鼠抗炎免疫调节及穴位皮肤免疫激活; 2.艾灸促使穴位皮肤树突细胞募集、激活，树突细胞参与艾灸足三里促使AA小鼠穴位皮肤免疫激活; 3.肥大细胞脱颗粒驱动树突细胞募集可能是艾灸穴位皮肤免疫激活的关键路径。
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