摘要
口蹄疫(Foot-and-mouthdisease,FMD)是偶蹄类动物高度感染的一种烈性传染病，由口蹄疫病毒(Foot-and-mouthdiseasevirus,FMDV)引起，我国将口蹄疫列为一类动物疫病。FMDV基因组在细胞内先翻译为一个多聚蛋白，通过多个蛋白酶的裂解，最终形成4种结构蛋白和10种非结构蛋白。这四种结构蛋白组成一个原粒(5S),每五个原粒的顶点相连形成一个五聚体(12S),12个五聚体又构成病毒衣壳(75S)。病毒衣壳和RNA结合形成完整的FMDV病毒粒子(146S)。但是，这种146S粒子极不稳定，当pH值下降或温度上升时，146S粒子会裂解成单独的五聚体。由于五聚体的免疫原性显著低于146S,导致了灭活疫苗的免疫效力降低。已有研究表明，各五聚体的连接面存在多种不稳定的分子间作用力降低了146S的稳定性，本论文利用Alphafold2预测模型、Discoverystudio2019(DS)同源建模，通过分子间作用和自由能分析及pymol中的Mutagenesis模块模拟氨基酸突变对结构的影响，构建SEA-Mya98毒株及FMDV多个突变cDNA克隆、利用BSR-T7细胞拯救FMDV并检测其生物学特性及病毒增殖能力，具体内容如下: 1.已有研究表明A型较O型口蹄疫病毒耐酸耐热能力更强，通过A型和O型的结构蛋白氨基酸序列比对，发现在O型FMDV稳定性关键位置上，A型FMDV具有较稳定的氨基酸序列，利用DS服务器和Alphafold2对目标序列的三维空间结构进行重构，TM值模型评分及拉马氏图评估选取优势结构，从分子间作用力及自由能预测分析氨基酸突变对结构的影响。将已报道的稳定性位点进行自由能计算，计算结果与报道结果相一致。通过DS软件扫描二重轴位置附近氨基酸，进行丙氨酸替换，将预测到的不稳定氨基酸进行氨基酸互换。结果发现将VP2的78位酪氨酸突变为亮氨酸自由能降低0.74Kcal/mol,以期提高146S的稳定性。 2.在已构建的SEA-Mya98毒株FMDV全长克隆载体的基础上，利用融合PCR和双酶切技术成功构建了含有3种氨基酸残基突变(A1013T、D2086H、Y2078L)的FMDV全长cDNA克隆，质粒利用NotⅠ单酶切线性化后转染BSR-T7细胞进行病毒拯救，之后使用BHK-21细胞进行病毒传代，最终获得CPE明显并且序列正确的四株FMDV(Re-Mya98、Re-Mya98A1013T、Re-Mya98D2086H、Re-Mya98Y2078L)。 3.将重组病毒在BHK-21细胞连续传10代，病毒遗传稳定，并测定F10代的病毒增殖曲线，在60h病毒滴度达到最高，Re-Mya98为6.4×106PFU/mL、Re-Mya98A1013T为2.8×106PFU/mL、Re-Mya98D2086H为1.2×106PFU/mL、Re-Mya98Y2078L为1.6×106PFU/mL,对比重组病毒与骨架病毒的一步生长曲线，重组病毒与骨架病毒增殖曲线基本一致。酸热失活实验结果显示重组病毒稳定性均高于骨架病毒，遗传稳定性分析结果表明突变位点均可稳定遗传。
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