摘要
卡那霉素（Kanamycin，KAN）是卡那链霉菌产生的一种碱性氨基糖苷类抗生素，是我国畜禽和水产养殖中的常用兽药。由于其对多数革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌有广谱抗菌作用，以及具有成本低廉和用药方便等优点，被广泛应用于治疗由大肠杆菌、变形杆菌、结核杆菌和金黄色葡萄球菌等细菌引起的各类感染。但是，过量使用抗生素会导致其在肉、蛋、奶制品及其他动物源性食品中的残留，并通过内循环系统在人体内蓄积，最终造成一系列的危害，如：耳毒性和肾毒性，还会对神经肌肉接头造成阻滞结果，导致过敏反应等，如果情况严重的话，还会导致人的死亡。因此，亟需建立一种快速、灵敏、准确的检测方法用于监控KAN的残留。 第一章系统地介绍了目标分析物KAN的理化性质、抑菌机理、毒性机理、限量标准及检测研究进展，阐述了免疫层析方法（Lateralflowimmunoassay，LFIA）标记物的类型，最后简述了本研究的内容、目的和意义。 第二章使用免疫学和细胞融合技术制备了抗KAN单克隆抗体（Monoclonalantibody，mAb）。采用戊二醛法合成全抗原KAN-牛血清白蛋白（Bovineserumalbumin，BSA）作为免疫原对小鼠进行免疫，通过间接竞争酶联免疫吸附法监测小鼠血清的效价，选择阳性和抑制率均较好的小鼠进行冲击免疫，通过细胞融合得到能产生抗KAN-mAb的阳性杂交瘤细胞，腹水的制备采用体内诱生法，纯化方法为正辛酸-饱和硫酸铵，最后得到5种抗KAN-mAb（1D11、1C9、1E12、2E3和2D1）。对mAb的灵敏度进行评价，结果显示mAb-1D11灵敏度最高，最后对该mAb进行亲和力和特异性评价。 第三章基于抗KAN-mAb和胶体金纳米微球（Colloidalgoldnanospheres，AuNPs）建立了一种快速检测猪肉和牛奶中KAN残留的LFIA。本研究使用柠檬酸钠还原法制备了AuNPs，采用静电吸附法将AuNPs和mAb偶联，并通过透射电镜、动态光散射和紫外-可见分光光度计对AuNPs和AuNPs-mAb进行了表征。对相关参数进行了优化，最终选择探针标记pH为5.5、mAb的标记量为6μg、检测线（Tline，T线）上KAN-BSA的浓度为0.6mg/mL、质控线（Cline，C线）上羊抗鼠二抗的浓度为0.7mg/mL，探针添加量为2.5μL以及免疫反应时间为16min。在最优条件下，所建立的AuNPs-LFIA的线性方程为y=?304.93lg(x)+684.08（R2=0.9859），线性范围为2-100ng/mL，检测限（Limitofdetection，LOD）为0.1124ng/mL。猪肉和牛奶的加标回收率范围为91.80%-119.50%，变异系数均小于15%。结果表明，本章所建立的AuNPs-LFIA可为KAN残留的快速检测提供技术支持。 第四章基于抗KAN-mAb和具有优异吸收能力以及较强比色信号的Fe3+螯合聚多巴胺纳米微球（Fe3+-chelatedpolydopaminenanospheres，Fe@PDANs），建立了一种灵敏检测KAN残留的LFIA。优化了相关实验条件，包括探针标记pH、mAb标记量、mAb和Fe@PDANs的孵育时间、T线上KAN-BSA的浓度、探针添加量以及免疫反应时间。在最佳条件下，Fe@PDANs-LFIA的LOD为0.0191ng/mL，相较于PDANs-LFIA，本方法的灵敏度提高了2.75倍。Fe@PDANs-LFIA检测猪肉、牛奶、蜂蜜和奶粉中KAN残留的LOD分别为0.1421、0.1982、0.2901和0.2743μg/kg，对应的线性范围分别为：0.5-100、0.5-50、0.5-50和1-20μg/kg。Fe@PDANs-LFIA具有良好的回收率及较低的变异系数，表明了该方法有良好的准确性。 第五章系统地总结了本研究合成的抗KAN-mAb以及建立的AuNPs-LFIA和Fe@PDANs-LFIA两种方法，对未来提高KAN残留检测灵敏度的方法进行了展望。
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