摘要
乳清分离蛋白（WheyProteinIsolate,WPI）是一种由生产干酪的副产物乳清通过分离技术得到的蛋白含量在90％以上的乳清蛋白产品。乳清蛋白包含多种功能性蛋白成分（如β-乳球蛋白、α-乳白蛋白、牛血清白蛋白和免疫球蛋白），乳清蛋白衍生肽由于其特定的氨基酸序列，对于机体维持身体功能有着重要作用。目前，大多数关于蛋白质生物活性、生物活性肽的筛选以及制备的研究往往以其体外理化测定指标为依据，其在体内胃肠消化过程中的功能性及变化少有研究。随着全球老龄化进程加快，针对于老年人特殊消化模式下的蛋白质结构、消化特性及生物学活性的研究十分必要。高静水压（HighHydrostaticPressure,HHP）被证明是一种有效的改善食源性蛋白质生物活性的处理方式。基于此，采用不同压力的HHP处理WPI,经过体外模拟老年人消化后，对HHP改性后的WPI在消化过程中蛋白质结构、消化特性、抗氧化活性及其消化产生的抗氧化肽进行系统研究;同时，通过分子对接技术筛选牛乳清蛋白源抗氧化肽，对比和补充WPI模拟老年人消化过程中产生的抗氧化肽。本研究一方面可以为HHP改善WPI在老年人消化过程中的抗氧化活性提供理论依据，另一方面为乳清蛋白源抗氧化肽的鉴定和筛选提供研究方法。主要研究结果如下: （1）研究了不同压力的高静水压处理对体外模拟老年人消化过程中WPI蛋白质结构和消化特性的影响。研究结果表明，在未消化阶段，WPI样品的固有荧光强度和游离巯基含量随着HHP处理压力的升高而显著增加（P＜0.05）,使样品原来致密小孔状的结构挤压为片状的蛋白结构;在胃消化阶段，随着HHP处理压力的增加，样品呈现出α-螺旋和β-折叠的含量逐渐下降，无规则卷曲的含量、最大荧光强度、游离巯基含量逐渐上升的趋势（P＜0.05）,β-乳球蛋白条带逐渐变浅，小分子条带逐渐加深;在肠消化阶段，HHP处理对于荧光强度的影响程度减弱，且相较消化前的样品游离巯基含量减少，样品进一步分解为颗粒与纤维絮状，增加了蛋白孔洞的数量与深度，所有电泳条带几乎全部消失，其体外消化率和水解度较胃消化阶段均显著提高（P＜0.05）。 （2）研究了不同压力的高静水压处理对体外模拟老年人消化过程中WPI抗氧化活性和消化产生的抗氧化肽的影响。研究结果表明，随着处理压力的增加，体外抗氧化活性（ABTS+自由基清除能力、DPPH自由清除能力及Fe3+还原力）和细胞抗氧化活性（ROS、MDA、SOD、GSH及CAT）均表现出显著增强的变化趋势（P＜0.05）,并在600MPa-WPI肠道消化物中，鉴定出15种特异性抗氧化肽，其多肽链特征和生物活性预测显示与生物活性肽特征相匹配。其中，LGSDMEDLR肽序列具有最高的“-CDOCKER能量”，与Arg380、Arg415、Arg483、Tyr334和Asn382形成盐桥、吸引力电荷、常规氢键、碳氢键和范德华力，均位于Keap1-Nrf2相互作用的结合位点。 （3）研究以Uniprot数据库中的主要牛乳清蛋白序列为来源筛选潜在的抗氧化肽。应用PeptideRanker程序对牛乳清蛋白序列的生物活性进行预测评分，筛选得到137条评分大于0.4的肽段，同时采用ToxinPred、Innovagen、Expasy-compute及Pepdraw程序对肽段进一步预测分析理化性质，并通过药物代谢动力学ADMET、TOPKAT分析筛选得到14条无毒、无致敏性、无致突变性、无致癌性及水溶性良好的多肽，然后将其与Keap1受体进行分子对接，最终通过复合物构象分子间作用力评价得出CDEF序列最具抗氧化活性潜力，而其分子对接的抗氧化评分低于HHP预处理WPI获得的LGSDMEDLR。 综上所述，高静水压处理可以有效改善WPI及其在体外模拟老年人消化过程中的结构特性,显著提高其消化率、体外及细胞抗氧化活性，并从其消化产物鉴定得到具有抗氧化潜力的特异性抗氧化肽，可以通过分子对接技术虚拟筛选得到牛乳清蛋白源抗氧化肽。说明高静水压是一种潜在的乳品工业上的非热加工方式，同时分子对接技术是一种有效的筛选抗氧化肽的策略。
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