摘要
目的:本研究在临床观察的基础上，通过体外细胞实验及体内动物实验研究，对复方瘢痕消抑制增生性瘢痕的作用靶点与作用机制进行探索，并进行初步制剂研究，为后期临床制剂开发提供参考及理论依据。 方法: （一）利用LC-MS技术对复方瘢痕消提取物主要成分丹参酮ⅡA、二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、粉防己碱、防己诺林碱进行含量测定。正交实验设计优化复方瘢痕消乳膏处方，根据乳膏剂外观性状、黏稠度、细腻度、涂展性进行考察评分，制备符合要求水包油型乳膏剂。 （二）采用酶消化法进行增生性瘢痕成纤维细胞原代培养，并通过Vimentin蛋白细胞免疫荧光进行细胞鉴定;通过CCK8进行筛选复方瘢痕消提取物给药时间和给药浓度;通过细胞划痕实验观察复方瘢痕消提取物对增生性瘢痕成纤维细胞迁移能力的影响。 （三）使用TGF-β1诱导增生性瘢痕成纤维细胞，加入复方瘢痕消提取物培养，采用Westernblot检测细胞α-SMA、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原的影响,细胞免疫荧光观察细胞α-SMA的表达，评估复方瘢痕消提取物对增生性瘢痕成纤维细胞细胞外基质的影响。 （四）使用TGF-β1诱导增生性瘢痕成纤维细胞，加入复方瘢痕消提取物培养，采用Westernblot检测HSFb细胞中USP4、TGF-β1、Smad2、Smad7蛋白表达水平。通过慢病毒构建高表达USP4HSFb细胞系，使用TGF-β1诱导后，加入复方瘢痕消提取物培养，采用Westernblot检测细胞α-SMA、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、USP4、TGF-β1、Smad2、Smad7蛋白表达水平。 （五）制备巴马小型猪增生性瘢痕模型，进行复方瘢痕消凡士林混合物治疗2周、4周进行评价抑制作用，用HE染色评价病理情况，Masson染色评价其对胶原的影响，用透射电镜评价其对增生性瘢痕成纤维细胞的影响,免疫组化观察对皮肤组织中USP4、TGF-β1、Smad2、Smad7蛋白表达的影响。 结果: （一）建立稳定应用HPLC-Q-TOF-MS/MS测定丹参酮ⅡA、二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、粉防己碱、防己诺林碱方法，测得复方瘢痕消提取物中丹参酮ⅡA平均含量为0.1818mg/g,隐丹参酮平均含量为0.5647mg/g,二氢丹参酮Ⅰ平均含量为0.1968mg/g,防己诺林碱平均含量为1.7176mg/g,粉防己碱平均含量为11.4075mg/g。通过正交实验设计得出制备复方瘢痕消乳膏最佳制备工艺和处方，符合质量要求。 （二）原代培养提取细胞在形态上呈梭形，细胞体较大，细胞有伪足，Vimentin蛋白细胞免疫荧光实验阳性，鉴定增生性瘢痕成纤维细胞原代培养成功;CCK8实验筛选出瘢痕消提取物给药浓度为:12.5μg/mL、25.0μg/mL和50.0μg/mL,给药时间为48h;细胞划痕实验得出BHX浓度依赖型著性影响增生性瘢痕成纤维细胞迁移，在50.0μg/mL浓度条件下，基本上细胞迁移能力完全被抑制。 （三）Westernblot实验得出TGF-β1能够增加HSFb中α-SMA、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原的表达（P＜0.05），而BHX能够显著性抑制TGF-β1诱导的HSFb细胞中α-SMA、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原表达上调（P＜0.05，P＜0.01）。 （四）复方瘢痕消提取物可以降低增生性瘢痕成纤维细胞USP4、TGF-β1、Smad2蛋白的表达，促进Smad7蛋白的表达。通过慢病毒转染高表达USP4实验，复方瘢痕消提取物可以抵消USP4、TGF-β1、Smad2的高表达，增加Smad7蛋白的表达。 （五）复方瘢痕消可以抑制巴马小型猪增生性瘢痕模型生长，可以减少胶原、血管生成，改善增生性瘢痕组织结构。 结论: （一）药剂学实验:建立测定复方瘢痕消主要成分方法，初步制备符合2020版《中国药典》规定的复方瘢痕消乳膏。 （二）细胞实验:复方瘢痕消提取物可以抑制增生性瘢痕成纤维细胞增殖与迁移，减少胶原及细胞外基质增生。复方瘢痕消提取物抑制增生性瘢痕与USP4/TGF-β1/Smad信号通路有关。 （三）动物实验:复方瘢痕消可以抑制巴马小型猪增生性瘢痕模型生长,可以减少胶原、血管生成，改善增生性瘢痕组织结构，验证了其药效作用。
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