摘要
铁皮石斛是兰科石斛属植物，目前已被中国药典收录，属于我国食药同源的食物。铁皮石斛中富含了石斛碱、石斛多糖、酚类、黄酮类等，同时具有抗炎、抗肿瘤、降血糖等多种生物活性作用。铁皮石斛多糖是其重要的功能物质，但由于其分子量大，结构复杂，限制其作用。为提高石斛多糖的功能活性与应用范围，本研究利用乳酸菌发酵铁皮石斛多糖，并使用超滤技术获取其中关键活性多糖，结合现代分离技术对多糖进行分离纯化，并表征该多糖的结构。此外，本论文通过建立小鼠酒精性肝损伤模型，对多糖的功能活性进行评价，并从microRNA角度探究了铁皮石斛多糖干预酒精性肝损伤的通路。主要研究内容如下: (1)乳酸菌发酵铁皮石斛多糖的提取与结构表征 构建乳酸菌-铁皮石斛发酵体系，利用超滤分离法提取关键活性多糖(KFDP),经过纯化获得单一的发酵铁皮石斛多糖组分。通过测定该多糖的分子量、单糖组成，并结合近红外光谱分析、甲基化分析和核磁共振光谱对该多糖的初步结构进行解析。结果显示，KFDP分子量为2.13kDa;主要由阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖组成，其摩尔比为0.13∶0.50∶24.38∶74.98;主要的糖苷键为→4)-β-D-Manp(1→、→4)-β-Glcp(1→、β-D-Manp(1→、β-D-Glcp(1→。 (2)发酵石斛多糖对小鼠酒精性肝损伤的保护作用 为评价发酵石斛多糖的功能，构建小鼠酒精性肝损伤模型，将小鼠分为空白对照组(CK)、美他多辛300mg/kg(阳性)、酒精模型组、KFDP组(40/80/160mg/kg)、石斛多糖KDP组(40/80/160mg/kg)。通过测定肝细胞内相关物质含量、酶活性、炎症因子的含量，综合评估石斛多糖对酒精性肝脏的治疗效果。结果表明，80mg/kg的KFDP可以提高细胞SOD活性，减缓GSH、GSH-Px、GR的消耗，同时降低MDA、AST、T-AOC及ALT的含量，调节炎症因子IL-6、TNF-α、IL-1β水平，且KFDP对酒精肝损伤的干预效果显著高于同剂量的KDP。实时荧光定量显示，KFDP显著上调GSH-Px、下调IL-6和Caspase-3的表达，以维持肝细胞功能结构的正常，减缓肝细胞的凋亡速率。 (3)miRNA水平探究发酵石斛多糖对酒精性肝损伤的保护作用 分别取空白对照组、酒精模型组、80mg/kg的KFDP组肝组织提取RNA及鉴定,Illumina测序被用于筛选miRNA差异表达，对显著的差异表达miRNA进行qPCR验证，对该miRNA进行靶基因预测，取TargetScan、miRanda靶基因检测的交叉结果作为预测结果，并同时开展靶基因的GO(GeneOntology)富集研究，以及基于KEGG的pathway富集分析。结果显示，酒精肝细胞中59个miRNA上调，61个miRNA下调。通过靶基因功能与通路富集结果，最终获得靶向关系miR-150-5p与Pik3r1。QPCR结果显示KFDP下调了miR-150-5p的表达，上调了Pik3r1的表达，双荧光素酶基因试验证实其相关性。由此证明KFDP通过抑制miRNA-150-5p的表达，靶向促进Pik3r1的表达来保护酒精性肝损伤。
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