摘要
目的： 本研究首先对MESP1与肿瘤相关的生物信息进行分析，再从临床肝细胞癌样本中MESP1的异常表达为出发点，通过体外实验观察肝癌细胞系HepG2和Hep3B在下调MESP1后Wnt/β-catenin信号转导通路分子水平的变化，对肿瘤细胞增殖、凋亡、迁移和转移以及线粒体功能的影响，并观察下调MESP1对5-FU抗肿瘤作用的影响。 方法: 1.分析TCGA与GTEx数据库中MESP1在泛癌中的异常表达情况，使用cBioportal数据库检索MESP1的突变情况。 2.在TCGA数据库来源的HCC样本数据中分析MESP1与免疫检查点基因SIGLEC15、TIGIT、CD274、HAVCR2、PDCD1、CTLA4、LAG3和PDCD1LG2的相关性，同时在HepG2和Hep3B细胞中敲低MESP1的表达来验证相关基因的变化情况。 3.在TCGA数据库来源的HCC样本数据中分析MESP1与患者临床STAGE分期、病理学分级和TNM分期之间相关性，以及与患者无病生存期(Disease-freeInterval,DFI)、总生存期(OverallSurvival,OS)和无进展生存期(Progression-freeInterval,PFI)的相关性。 4.收集未经化疗的48例成人肝细胞癌组织(穿刺活检或手术切除标本)的石蜡切片,将其中34例肿瘤的瘤旁组织作为对照,采用免疫组化检测MESP1的表达水平并分析其与患者临床分期、组织学分化以及转移的相关性。 5.使用siRNA下调肝癌细胞株HepG2与Hep3B的MESP1表达水平，采用CCK8检测细胞活力、EDU检测细胞增殖、流式细胞术检测细胞凋亡和周期、划痕实验检测细胞侵袭能力变化。 6.通过RT-qPCR检测C-myc、PARP1及凋亡相关分子Bcl2和Caspase3；EMT相关分子SNAILl、MMP9和E-cadherin的变化。 7.使用四甲基罗丹明（TMRE）荧光探针测定细胞线粒体膜电位（MMP）变化。 8.通过RT-qPCR和WB检测到Wnt/β-catenin信号转导通路中主要分子β-catenin和GSK3β表达水平变化。 9.siRNA干扰MESP1联合五氟尿嘧啶，检测肝癌细胞株HepG2和Hep3B细胞增殖、凋亡和细胞周期的变化。 结果: 1.MESP1在泛癌组织中高表达，而在正常组织中低表达，两者之间存在显著差异。使用cBioPortal分析显示，MESP1基因突变的频率在胃癌最高(gt;4%)并以基因扩增为主；MESP1在肉瘤、卵巢癌、食管癌、间皮瘤和胰腺癌中也存在基因扩增。 2.TCGA数据库分析结果显示HCC组织中MESP1的表达水平与免疫检查点基因SIGLEC15、TIGIT、CD274、HAVCR2、PDCD1、CTLA4、LAG3和PDCD1LG2表达水平均显著相关。采用siRNA干扰MESP1后，通过PCR检测分析发现HepG2细胞中CD274和PDCD1明显表达下调，Hep3B细胞中PDCD1明显表达下调。 3.对TCGA收集到的HCC临床信息分析结果显示肿瘤组织高表达MESP1与STAGE分期晚、病理学分级差以及TNM分期晚明显相关，而且MESP1高表达组患者的DFI、OS和PFI均短于MESP1低表达组的患者。 4.免疫组化检测结果显示48例肝细胞癌组织中41例（85.42%）高表达MESP1，7例（14.58%）低表达MESP1,而34例（100%）瘤旁组织均低表达MESP1，癌组织MESP1表达量显著高于瘤旁组织(Plt;0.001)；且MESP1的高表达与患者临床分期晚、组织学分化差、肿瘤体积更大以及转移相关。 5.siRNA下调MESP1表达48h后，HepG2和Hep3B细胞均活力下降、增殖能力减弱；HepG2凋亡率由3.36%增加到22.9%，G1细胞期占比从46.84％增至71.34％，而S期占比从39.49％减至21.34％；Hep3B凋亡率由3.8%增加到22.4%，G1期细胞占比从52.56％增至72.48％，S期占比从36.63％减至19.18％；划痕试验结果显示癌细胞迁移能力降低。 6.siRNA干扰MESP1表达48h后，HepG2与Hep3B细胞内C-myc、PARP1及Bcl2、SNAIL1、MMP9表达减少，而Caspase3与E-cadherin的表达上调。 7.siRNA下调MESP1表达48h后，HepG2细胞内线粒体的膜电位由105.9降至37.31，Hep3B细胞内膜电位由87.42降至42.47。 8.WB与RT-qPCR结果显示，siRNA下调MESP1表达48h后：HepG2和Hep3B细胞的Wnt/β-catenin信号转导通路中主要分子β-catenin和GSK3β表达水平下调。 9.干扰MESP1的表达明显增强了五氟尿嘧啶（5-FU）作用，癌细胞凋亡率增高、G1-S期阻滞效果显著。 总结: 本研究结果表明，MESP1是一个泛癌基因，MESP1与免疫检查点表达明显正相关。MESP1在肝细胞癌中表达水平异常升高并与患者的临床结局不良相关。下调肝癌细胞MESP1水平可抑制Wnt/β-catenin途径信号分子β-catenin和GSK3β表达；干扰癌细胞的细胞周期运行、使癌细胞增殖能力下降；同时使癌细胞线粒体膜电位降低并促进癌细胞凋亡；还可致癌细胞内SNAIL1和MMP9表达减少，E-cadherin表达升高而抑制其迁移。干扰MESP1的表达可明显增强5-FU的抑癌效果。 本实验结果提示MESP1可能成为肝癌治疗与诊断的新靶点。
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