摘要
目的：UC（ulcerativecolitis）是一种慢性连续性弥漫性炎症疾病，发病机制尚不明确，近几年，中国的发病率持续增加，主要作用于结肠黏膜，病变多发生于结肠远端。UC持续时间长，且容易反复发作，是一种全球性疾病。桑黄多糖作为桑黄中主要活性成分，具有显著的抗炎生物活性，目前相关研究报道指出通过将桑黄多糖制备为新型功能性食品，可缓解溃疡性结肠炎患者症状。但桑黄多糖对溃疡性结肠炎其作用机制仍不明确，本课题目的为首先优化桑黄多糖的提取工艺；进而对其进行分离纯化并进行结构解析，明确其活性成分；随即对桑黄多糖颗粒剂进行制备；最后采用体外RAW264.7系细胞及C57BL/6溃疡性结肠炎小鼠模型进行验证，阐明桑黄多糖的抗结肠炎功效。 方法：首先本文对桑黄多糖的提取工艺进行考察，采用单因素法确定其提取工艺范围，随即通过响应面法对其提取工艺进行优化，确定最佳提取工艺条件。其次采用Sevage法除蛋白、大孔树脂吸附、除盐对桑黄粗多糖进行纯化，然后经DEAE-Cellulose离子交换柱（Cl—型）、SephacrylS-200HR分离出均一多糖，采用紫外光谱法、红外光谱法、核磁共振波谱法及甲基化分析对其结构进行解析，初步推断其多糖结构特征。 为进一步扩大桑黄多糖的应用，本文随即对桑黄多糖颗粒剂的制备工艺进行考察，主要考察指标分为以下几点：辅料的选择、混合辅料的配比、原辅料配比、润湿剂乙醇的浓度，随后通过质量检查确定颗粒剂是否合格，本文初步确定了桑黄多糖颗粒剂的制备工艺。为其中试生产及产品开发具有指导性意义。经体外细胞实验和小鼠实验验证桑黄多糖对溃疡性结肠炎是否有保护作用。 为进一步明确桑黄多糖的体外细胞抗炎活性，选用小鼠单核巨噬细胞RAW264.7为研究对象，通过LPS对炎症模型进行诱导，使用酶联免疫吸附测定法（Enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA）检测细胞中炎症因子IL-6、TNF-α的含量水平；逆转录PCR法（ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction,RT-PCR）检测炎症因子IL-6、TNF-α、IL-1βmRANA的表达，以观察空白组、模型组、高中低剂量给药组间的差异表达；通过Westernblot分析桑黄多糖抗炎潜在作用机制，检测各组间相关蛋白的表达含量；进而为其后续动物体内抗炎特性及作用机制等方面的研究提供前期基础。 为进一步明确桑黄多糖对溃疡性结肠炎小鼠肠道炎症的调节作用，以C57BL/6小鼠为模式生物，以DSS（dextransulfatesodiumsalt）为炎症诱导药物，分组情况为空白组（Normal）、阳性药组（5-ASA）、模型组（DSS）及高低剂量给药组（100mg/kg，50mg/kg）。通过观察并记录各组小鼠的体重变化、粪便成型性、便血程度，疾病活动指数（DAI评分）、各组小鼠结肠长度与质量、苏木精－伊红染色法（Hematoxylin-Eosinstaining，HE）进行病理学考察及评价；采用酶联免疫吸附测定法（Enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA）检测小鼠结肠中炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α的含量水平，通过Westernblot分析桑黄多糖调控小鼠结肠中的炎症通路，检测通路中相关蛋白的表达量，最终证明桑黄多糖在小鼠体内具有显著抗炎作用，为桑黄多糖的进一步开发提供临床前基础。 结果：单因素实验结果确定桑黄多糖的提取工艺范围为：提取时间1.5h-2.5h，提取温度65℃-75℃，料液比为1：14g/ml-1:16g/ml，随即通过响应面法优化最终确定桑黄多糖的提取工艺为，提取温度75℃，提取时间2h，料液比为1：16g/ml为最佳提取工艺，收率为2.74%。最后本文进行三批次实验进行验证，最终得出其方法稳定可行。分离纯化：经DEAE-Cellulose离子交换柱（Cl-型）对精致粗多糖进行分级，结果显示酸性糖为主要组成部分，含量达到65以上，而中性糖大约为6%，因此利用SephacrylS-200HR将酸性糖进一步分离出均一多糖，得到桑-A1、A2、A3三种多糖，其中桑-A3纯度最高为90.1%，且电荷和分子量分布均一，因为桑-A2得率较低，桑-A3分子量分布不均一，因此主要对桑-A3进行结构分析，结果显示要桑-A3由Gal、Glc、Man和GlcA组成，同时含有少量的Fuc、Xyl、GalA及Rha，紫外光谱结果显示波长260nm和280nm处均未检测到明显的核酸和蛋白质的吸收峰，表明纯度较高，红外光谱结果显示，出现多糖典型的特征吸收峰，1018cm-1附近的振动吸收峰为C?O?C的伸缩振动吸收峰，说明其均一级分中存在吡喃环构象，旋光度结果为+18°，右旋，甲基化结果可推测桑-A3中可能存在葡聚糖、甘露聚糖和半乳聚糖三种结构域，核磁结果推测桑黄多糖均一级分中存在以α-1,6-D-Galp为主链，在部分Gal的O-2位连有末端T-β-L-Manp的结构域，至于此甘露半乳聚糖与其他葡聚糖、甘露聚糖等结构域如何连接尚不清楚。 桑黄多糖颗粒剂的制备工艺的结果如下所示：本文选用可溶性淀粉和乳糖作为混合辅料，80%乙醇作为润湿剂，混合可溶性淀粉与乳糖比例为淀粉：乳糖（3：1），原辅料配比为1：2；经质量检查，桑黄多糖颗粒在5min内均可完全溶解于热水中；过一号筛和不过五号筛总量8.14%＜15%；水分含量为6.88%＜8%，粒度及颜色均匀，符合2020版《中国药典》的规定，表明该工艺条件稳定可行，可作为桑黄多糖颗粒剂的制备工艺前期基础，为中试生产及研发提供可行性参考。 体外抗炎细胞实验结果表明，经桑黄多糖给药后，在7.8125-31.25μg/ml的浓度下，促炎因子IL-6、TNF-α含量显著降低（P＜0.05或P＜0.01），IL-6、IL-1β、TNF-α的mRNA表达量显著降低。Westernblot实验结果表明，桑黄多糖高中低剂量组均不同程度下调了P65、P38、ERK、JNK、AKT的磷酸化蛋白表达。 本文选取桑黄多糖以100mg/kg、50mg/kg为高低剂量，桑黄多糖对溃疡性结肠炎小鼠的抗炎实验结果表明，与模型组相比，给药组与阳性药组均减缓了小鼠体重的下降（P＜0.05）；随即本文研究发现给药组小鼠结肠长度与模型组相比显著变长((P＜0.01)，促炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α含量显著降低（P＜0.05或P＜0.01），Westernblot实验结果与体外细胞实验呈现一致性，可相互佐证桑黄多糖在体内外均调控了NF-κB、AKT、MAPK信号通路，从而发挥抗炎作用。 结论：本文通过对桑黄多糖提取工艺的优化考察，利用单因素结合响应面法最终确定最佳提取工艺为：提取温度75℃、提取时间2h，料液比1：16mg/ml；随即通过分离纯化后均一性最好、纯度最高的为酸性糖桑-A3，由Gal、Glc、Man和GlcA组成；本文对桑黄多糖颗粒剂的制备工艺进行初步考察，经质量检查后确定其稳定可靠；采用体内外实验相结合的方式分别考察了桑黄多糖对小鼠单核巨噬细胞RAW264.7的抗炎作用评价，随即观察结肠炎模型小鼠的结肠长度、病理切片、生化指标等影响，最终证实了桑黄多糖可调控NF-κB、AKT、MAPK信号通路，初步确定了桑黄多糖的抗炎机制。本文为桑黄颗粒剂的生产及临床应用提供数据支持。
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