摘要
第一部分太子参多糖的分离纯化及其理化性质的分析 目的 从太子参中提取分离出均一纯化的多糖片段，并对其纯度、分子量大小和单糖组成以及总糖含量、糖醛酸、蛋白含量和特征性官能团等理化性质进行分析。 方法 1.太子参粗多糖的提取：选取太子参为原料，通过水煮醇沉、Sevag法除蛋白、透析后冷冻干燥得到太子参粗多糖。 2.太子参多糖的分离纯化：将粗多糖先经过DEAEFastFlow阴离子交换柱分离，再经过SephacrylS-300凝胶柱进一步分离纯化得到均一纯化的太子参多糖片段PHP-1。 3.太子参多糖理化性质的鉴定：用苯酚硫酸法检测太子参多糖的总糖含量，间羟基联苯胺法测定糖醛酸含量，紫外可见光谱分析PHP-1中核酸和蛋白质的存在，刚果红实验分析PHP-1是否含有三螺旋结构，红外光谱分析PHP-1中的主要官能团。高效凝胶渗透色谱分析PHP-1的均一性和分子量大小，高效液相色谱检测其单糖组成。 结果 1.通过太子参多糖的提取和纯化，得到了均一纯化的太子参多糖片段PHP-1。 2.PHP-1的总糖含量为95.26±0.86%，糖醛酸含量为4.07±0.62%，紫外光谱扫描显示PHP-1不含核酸和蛋白质。刚果红实验显示PHP-1不含三螺旋结构，红外光谱分析显示PHP-1含有多糖大分子的特征性官能团。 3.高效凝胶渗透色谱显示PHP-1为均一纯化的多糖片段，分子量大小为60.99kDa，单糖组成：核糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖的摩尔百分比为0.9:2.5:0.5:93.1:1:0.9。 结论 通过对太子参多糖的提取和纯化得到了均一纯化的多糖片段PHP-1，并对其总糖含量、糖醛酸、特征性官能团、分子量和单糖组成等理化性质进行了鉴定，为下一步的免疫调节活性和机制的研究奠定了基础。 第二部分太子参多糖逆转M2型巨噬细胞抗肝癌机制的研究 目的 探讨太子参多糖PHP-1对M2型巨噬细胞表型的逆转作用和对淋巴细胞的影响，阐明其免疫调节抗肝癌效应，并分析其分子机制。 方法 1.使用IL-4或IFN-γ联合LPS分别诱导未刺激的RAW264.7向M2或M1型转化构建M2/M1型巨噬细胞模型。M1/M2模型诱导成功后利用PHP-1处理M2型巨噬细胞，检测其对巨噬细胞表型的影响。用Griess和ELISA检测NO、TNF-α和IL-1β的表达，PCR分析iNOS、CD206和Arg-1的基因表达，WesternBlot检测CD206的蛋白表达，流式检测CD86的表达情况。CCK8检测PHP-1对巨噬细胞、Huh-7、HepG2肝癌细胞存活率的影响。将M1/M2巨噬细胞与Huh-7和HepG2肝癌细胞共培养，分析PHP-1对Huh-7、HepG2肝癌细胞凋亡的间接作用以及对血管生成和侵袭相关因子MMPs、VEGF的影响。 2.建立H22肝癌荷瘤小鼠，观察了PHP-1对荷瘤小鼠肿瘤重量、体积、HE染色以及小鼠体重、免疫器官指数的影响。分析小鼠肿瘤组织中F4/80+iNOS+M1巨噬细胞和F4/80+CD206+M2巨噬细胞以及TNF-α、Arg-1和IL-10的表达情况。免疫组化和流式细胞术分别检测了PHP-1对小鼠肿瘤浸润CD8+T淋巴细胞和小鼠外周血CD4+/CD8+T淋巴细胞的影响。以脾脏淋巴细胞为效应细胞，Huh-7和HepG2肝癌细胞为靶细胞，分析脾脏淋巴细胞对肝癌细胞的毒性作用。 3.PCR和WesternBlot检测PHP1-模式识别受体TLR4的基因和蛋白表达情况，并通过抑制TLR4反向验证PHP-1对M2型巨噬细胞极化的影响。流式检测第二信使Ca2+的浓度，并观察抑制Ca2+表达后对PHP-1重塑M2型巨噬细胞表型的影响。 4.通过检测p-NF-κB、磷酸化MAPK（p38、JNK和ERK）的蛋白表达，并通过反向验证来分析NF-κB信号通路和MAPK信号通路对PHP-1重塑M2型巨噬细胞极化的影响。 结果 1.经IL-4诱导的RAW264.7巨噬细胞高表达CD206和Arg-1，呈M2表型；经IFN-γ联合LPS诱导的RAW264.7细胞高表达iNOS,NO、TNF-α、IL-1β和CD86，呈M1表型。PHP-1提高了M2型巨噬细胞中iNOS,NO、TNF-α、IL-1β和CD86的表达，降低了CD206和Arg-1的表达。PHP-1在体外不能直接抑制Huh-7、HepG2的生长，但将M2型巨噬细胞与肝癌细胞共培养后，PHP-1通过重塑M2型巨噬细胞的表型促进了Huh-7、HepG2的凋亡，并且抑制了MMPs（MMP2、MMP9）和VEGF的表达。 2.PHP-1提高了肝癌荷瘤小鼠的脾脏和胸腺指数，减小了肝癌荷瘤小鼠中肿瘤的体积和重量，HE染色显示PHP-1组肿瘤组织中存在大量的细胞坏死，小鼠的体重变化稳定。经PHP-1处理的肿瘤组织中F4/80+iNOS+M1巨噬细胞显著增多，TNF-α表达升高，F4/80+CD206+M2巨噬细胞减少，Arg-1和IL-10的表达降低。并且PHP-1促进了肿瘤组织中CD8+T细胞的浸润，恢复了脾脏淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤作用，有利于维持外周血CD4+/CD8+T淋巴细胞比例平衡。 3.PHP-1促进了巨噬细胞表面模式识别受体TLR4、下游Myd88分子以及第二信使Ca2+的表达，分别抑制TLR4和Ca2+后都阻断了PHP-1对M2型巨噬细胞中CD86、NO、TNF-α和IL-1β的上调作用，且抑制TLR4能够阻断下游Ca2+的释放。 4.经PHP-1处理后的p-NF-κB、磷酸化MAPK（p38、JNK和ERK）的表达都升高，但只有抑制了p-NF-κB、磷酸化p38和ERK时会阻断PHP-1对M2巨噬细胞的CD206表达的下调作用。 结论 PHP-1通过重塑M2型巨噬细胞为M1型和调节淋巴细胞在体内外发挥了免疫调节抗肝癌的作用。其分子机制主要是通过与M2巨噬细胞表面TLR4结合，促进Ca2+的释放以及刺激NF-κB、p38和ERK的磷酸化来重塑M2巨噬细胞表型。 第三部分太子参多糖金纳米复合物的制备及其免疫调节抗肝癌的研究 目的 合成太子参多糖金纳米复合物，并与单独的多糖作比较，探讨多糖金纳米复合物在肝癌中的免疫调节抗肿瘤活性。 方法 1.根据紫外可见光谱检测最大吸收峰，从最佳PHP-1浓度、反应时间、反应温度三个方面探讨合成太子参多糖金纳米（PHP-AuNPs）的最佳条件。使用透射电镜观察PHP-AuNPs的形态结构，动态光散射检测其粒径大小、分散指数和zeta电位。能量色散X射线光谱检测PHP-AuNPs中的元素组成，FT-IR分析PHP-AuNPs中存在的官能团。 2.在体外证实了PHP-AuNPs的安全性的基础上，通过PCR和ELISA检测了PHP-AuNPs对M2巨噬细胞中CD206的mRNA表达以及M1巨噬细胞相关细胞因子IL-1β表达的影响，并通过CCK8检测了PHP-AuNPs对脾细胞增殖的影响，并与单独的PHP-1进行比较。 3.建立H22荷瘤小鼠模型，记录小鼠的体重变化，通过计算抑瘤率，对肿瘤组织的HE和PCNA染色分析PHP-AuNPs的抗肿瘤作用，并与游离的PHP-1进行对比。检测小鼠血清ALT、AST、BUN、sCr的水平，对小鼠的心、肝、脾、肺、肾进行HE染色，评估PHP-AuNPs的体内安全性。通过PCR检测肿瘤组织中iNOS和Arg-1的mRNA表达以及流式检测小鼠外周血CD4+/CD8+T淋巴细胞来分析PHP-AuNPs对TAMs和淋巴细胞的免疫调节作用。 结果 1.确定了合成PHP-AuNPs的最佳条件为4mg/mL的PHP-1在80℃下与HAuCl4反应0.5h。紫外可见光谱分析得到PHP-AuNPs的最大吸收峰在530nm处左右，初步证实了PHP-AuNPs的合成。进一步透射电镜（Transmissionelectronmicroscope，TEM）观察到PHP-AuNPs为比较均匀的球形，大小为35nm左右，动态光散射分析得到的流体力学粒径大小为54.81nm，分散指数为0.260，zeta电位为-14mV。能量色散X射线测得PHP-AuNPs含有金元素以及红外光谱测得PHP-AuNPs含有多糖大分子的特征性官能团进一步证实了PHP-AuNPs的制备成功。 2.PHP-AuNPs在体外对正常细胞具有安全性。在体外降低了M2型巨噬细胞中CD206的表达，提高了M1巨噬细胞相关细胞因子IL-1β的表达，促进了脾细胞的增殖，比游离的PHP-1表现了出更好的免疫活性。 3.与NS对照组相比，PHP-AuNPs、PHP-1以及ADM在荷瘤小鼠体内能够显著降低肿瘤重量，HE染色显示肿瘤细胞坏死较多，肿瘤细胞增殖指数降低，且PHP-AuNPs对肿瘤的抑制作用强于单独的PHP-1。体内安全性实验发现PHP-AuNPs组肝肾功能生化指标正常，HE染色未见对主要器官的结构破坏，表现出良好的生物安全性，而ADM虽然抑瘤效果最好，但会对小鼠主要器官产生毒副作用，显著降低小鼠的体重。PHP-AuNPs在体内能够抑制肿瘤组织中的TAMM2中Arg-1的mRNA表达，促进iNOS的表达，提高小鼠外周血的CD4+/CD8+T细胞的比例，免疫活性强于单独的PHP-1。 结论 PHP-AuNPs在体内外都发挥了免疫调节抗肿瘤作用，且效应强于单独的PHP-1，这可能是由于纳米结构提高了多糖大分子PHP-1的稳定性，延长了半衰期，持续了PHP-1的药理活性。
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