摘要
胞内氧化还原水平对微生物新陈代谢具有重要的生理作用，氧化还原水平取决于胞内NADH/NAD+和NADPH/NADP+两种辅因子的含量和比例。产水型NADH氧化酶（NOX-2）以NADH、氧气为底物合成水的同时生成NAD+，广泛应用于调控微生物氧化还原反应和胞内代谢流。本研究以枯草芽孢杆菌来源的NADH氧化酶（BsNOX）为研究对象，基于表面电荷工程对其最适反应pH进行了改造，拓宽了BsNOX的pH作用范围，分别在碱性环境（pH9.0）下用酶催化合成L-塔格糖，观察了BsNOX的可用性及其对NAD+再生的能力，以及中性环境下用氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacteroxidans)62EH生产1,3-二羟基丙酮（DHA）。主要结论如下： （1）探究了BsNOX的酶学性质，发现其最适反应pH为9.0，在pH7.0时只有65%的相对酶活力；而且其在偏中性的条件下pH稳定性较差，在pH7.0、8.0两个条件下保存60h只有不到20%的残余酶活，而在pH9.0条件下保存60h仍有35%左右的残余酶活。同时该酶的热稳定性欠佳，在超过40℃的环境中酶活会快速丧失。 （2）为了拓宽BsNOX的pH作用范围进而提升其应用潜力，利用ROSETTA软件对其表面电荷进行了改造，得到8个突变位点，基于酶学性质表征发现，突变体NOXT2E、NOXN116E、NOXA118E在pH7.0条件下的酶活力相对于BsNOX分别提高了28%、45%、40%；在pH8.0条件下的酶活力相对于BsNOX分别提高了37.5%、6%、25%；在pH9.0条件下，三个单突变体的酶活力均无提高。随后经组合突变，得到突变体NOXT2E+N116E、NOXT2E+A118E、NOXN116E+A118E和NOXT2E+N116E+A118E，其中突变体NOXT2E+N116E和NOXT2E+N116E+A118E为正向突变体，在pH7.0条件下的酶活力相对于BsNOX分别提高了41%、30%；在pH8.0条件下的酶活力相对于BsNOX分别提高了10%、35%；在pH9.0条件下，前者的酶活力相对于BsNOX下降了13%，后者提高了11%。 （3）以L-塔格糖酶催化合成为例，探究了BsNOX及其突变体在偏碱性条件下循环再生NAD+的潜能。选用球形红细菌（Rhodobactersphaeroides）来源的半乳糖醇脱氢酶（GatDH）和在pH9.0条件下酶活力最高、稳定性最好的突变体NOXT2E+N116E+A118E构建催化D-半乳糖醇合成L-塔格糖催化耦连系统。对比于半乳糖醇脱氢酶单酶催化，在偶联体系下L-塔格糖的产量由40mg?L-1提升至335mg?L-1，提升了8.4倍；对比于和原始BsNOX构建偶联系统，L-塔格糖的产量提升了18%。后经过转化体系优化，确定了最适转化条件：500mg?L-1D-半乳糖醇、6U·mL-1酶添加量、0.18mmol·L-1NAD+、pH9.0、25℃、40μmol?L-1FAD，并采用底物流加与酶流加相结合的策略，通过监测底物剩余量补加底物、每8h补加酶，反应96h，L-塔格糖产量达到1302mg?L-1，转化率为86.8%。 （4）以G.oxidans62EH发酵法合成DHA为例，在G.oxidans中过表达最适催化pH为7.0的突变体NOXN116E，探究了胞内NADH/NAD+的水平对该发酵过程的影响。通过分批发酵实验发现，发酵28h重组菌株的DHA时空产率达到1.46g?L-1·h-1，比过表达原始BsNOX的重组菌株高了17%，比出发菌株高了28%。随后通过在重组G.oxidans中共表达同源的3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)和突变体NOXN116E，用于强化胞内NADH/NAD+循环再生效率。且在优化条件下采用分批补料的方式进行发酵，发酵60h，重组菌株GO-NOXN116E-GAPDH的时空产率从1.46g?L-1·h-1提升至2.0g?L-1·h-1，提升了36.9%，DHA产量达到120g?L-1，较原始菌提高了26.3%。
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