摘要
背景： 结肠癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，目前发病率逐渐增加，部分患者被发现时已处于晚期，预后较差。在结肠癌诊断、治疗等方面，临床上缺乏特异性的生物标志物，目前急需寻找新的预后标志物，为结肠癌患者的诊治提供一定的临床价值。实验室前期研究发现NKD1促进结肠癌进展，且通过Crispr/Cas9技术构建了敲除NKD1基因的结肠癌SW620-nkd1-/-细胞系，其与野生型SW620细胞系进行蛋白质组学检测差异表达蛋白，发现了羧肽酶D（CarboxypeptidaseD，CPD）。有研究发现CPD是一种蛋白水解酶，其在前列腺癌、肝细胞癌等癌种中高表达，并具有一定的临床意义，而CPD蛋白在结肠癌中的作用尚无文献报道。目的： 探讨CPD在结肠癌细胞及组织中的表达情况，及其表达与临床病理特征之间的相关性，并进一步研究CPD在结肠癌患者预后中的价值。 方法： 1.通过实时荧光定量PCR（quantitativeRealTimePCR，qRT-PCR）实验验证NKD1在结肠癌中高表达及分析其与CPD的关系。 2.通过GEPIA2数据库分析CPD在不同癌种中的表达情况。 3.通过UALCAN数据库分析CPD基因表达水平及甲基化水平与结肠癌临床病理特征的相关性。 4.通过cBioPortal数据库分析CPD在结肠癌中的突变情况及与预后的关系。 5.通过qRT-PCR实验探讨CPD基因在结肠癌细胞系及正常结肠细胞系中的转录水平，然后通过Western-Blot实验探讨CPD在结肠癌、正常结肠细胞系及组织中蛋白表达水平，通过免疫组织化学（Immunohistochemistry，IHC）实验进一步探讨CPD在结肠癌组织及癌旁组织中的蛋白表达量。 6.收集94例结肠癌患者的临床病理切片，通过IHC实验分为CPD阳性组、CPD阴性组，通过?2检验分析CPD表达与结肠癌患者临床病理特征之间的相关性，通过二元Logistic回归分析CPD表达与结肠癌患者预后的相关性，通过Kaplan-Meier分析绘制生存曲线，运用Cox回归模型分析CPD是否为结肠癌患者的独立预后因素。 结果： 1.qRT-PCR实验结果显示，对比癌旁组织，NKD1在结肠癌组织中的表达水平明显增高，其差异具有统计学意义（P＜0.05）。CPD在NKD1敲除的SW620-nkd1-/-细胞系中的mRNA表达显著下调，其差异具有统计学意义（P＜0.01）。 2.相比于正常组织，CPD在结肠癌、食管癌、胰腺癌以及肝细胞癌组织中高表达（P＜0.05）。而与弥漫性大B细胞淋巴瘤、腱鞘巨细胞瘤以及胸腺瘤组织相比，CPD在对应正常组织中的表达明显上调（P＜0.05）。 3.CPD分别在肿瘤分期、性别、年龄、种族、体重、组织亚型、淋巴结转移、TP53突变状态与对应正常组织之间的甲基化水平具有差异，其差异具有统计学意义（P＜0.05）。然而，CPD的甲基化水平在不同肿瘤分期、TP53突变状态、年龄、种族、性别、体重、组织亚型、淋巴结转移中的差异不具有统计学意义（P＞0.05）。CPD的基因表达水平分别在肿瘤分期、性别、种族、体重、组织亚型、淋巴结转移、TP53突变状态与对应正常组织之间具有差异，其差异具有统计学意义（P＜0.05）。CPD在不同年龄组间的基因表达水平差异具有统计学意义（P＜0.05）。但CPD的基因表达水平在不同肿瘤分期、性别、种族、体重、组织亚型、淋巴结转移、TP53突变状态中的差异不具有统计学意义（P＞0.05）。 4.1.9%（25例/1310例）的结肠癌患者病例中CPD基因发生了变化，包括基因扩增、错义突变、截短突变。其中基因扩增占0.2%（3例/1310例），错义突变占1.5%（20例/1310例），截断突变占0.2%（2例/1310例）。 在Genentech,Nature2012数据集中，CPD突变频率占1.39%（1例/72例），在TCGA,FirehoseLegacy数据集中，CPD基因改变占1.62%（10例/619例），其中突变频率占1.13%（7例/619例），基因扩增占0.48%（3例/619例）。在DFCI,CellReports2016数据集中，CPD基因突变占2.26%（14例/619例）。 通过Kaplan-Meier分析显示CPD改变组与CPD未改变组相比，其改变组总生存期更低，并且差异具有统计学意义（P＜0.05）。 5.qRT-PCR、Western-Blot实验结果显示，相比于NCM460正常结肠细胞系，CPD在SW620、RKO等结肠癌细胞系中表达上调，其差异具有统计学意义（P＜0.05）。Western-Blot、IHC实验结果显示，CPD在结肠癌组织中高表达，在癌旁组织中低表达。 6.?2检验结果显示CPD表达量在不同性别、年龄、淋巴结转移、分化程度、肿瘤部位、肿瘤浸润深度（T）、TNM分期上差异不具有统计学意义（P＞0.05）。二元Logistic回归分析结果显示CPD表达、淋巴结转移、TNM分期与结肠癌患者的预后相关（P＜0.05），性别、年龄、肿瘤部位、分化程度、T分期与结肠癌患者的预后无关（P＞0.05）。Kaplan-Meier分析结果显示CPD阴性组的1年生存率、3年生存率、5年生存率分别为：96.92%、83.08%、81.54%。CPD阳性组的1年生存率、3年生存率、5年生存率分别为：89.66%、65.52%、55.17%。CPD不同组3年生存率、5年生存率间的差异具有统计学意义（P＜0.007）。Cox回归分析结果显示CPD表达、淋巴结转移、TNM分期为结肠癌患者的独立预后危险因素。 结论： 1.NKD1在转录水平上调CPD的表达。 2.生物信息学分析结果提示CPD在结肠癌组织中高表达，CPD的甲基化水平在结肠癌患者不同年龄之间具有显著差异，CPD的基因表达水平与性别、年龄、肿瘤分期等结肠癌临床病理特征无关，CPD的总体基因改变与结肠癌患者的预后相关。 3.qRT-PCR、Western-Blot、IHC等实验进一步验证了CPD在结肠癌细胞及组织中高表达。 4.CPD可能作为结肠癌患者的独立预后危险因素。
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