摘要
对映互补醇脱氢酶可催化前手性酮的不对称还原合成两种相反构型的手性仲醇，其具有不同的生理活性，均可作为关键砌块分子用于合成医药、食品、香精香料等高附加值产品。开发可催化合成两种构型手性仲醇的对映互补醇脱氢酶对于揭示醇脱氢酶立体选择性识别和催化底物的分子机制、促进手性仲醇合成技术的可持续升级具有重要意义。然而，催化相同类型反应的天然酶通常表现出相同的立体选择性，具有对映互补性的天然酶较为少见。通过蛋白质工程对酶的立体选择性进行定向改造，可快速获得对映互补的醇脱氢酶，为两种构型手性仲醇的合成提供高效的生物催化剂。本论文以筛选获得的醇脱氢酶CgADH作为研究对象，通过定向改造获得对映互补性的突变酶，并研究了醇脱氢酶对不同结构底物的立体选择性识别机制。主要研究内容如下： （1）醇脱氢酶CgADH的发现及酶学性质表征。通过筛选本实验室构建Candidaglabrata羰基还原酶库，成功获得兼具氧化与还原活力的醇脱氢酶CgADH。根据氨基酸保守序列分析，CgADH属于Extended-SDR超家族，具有保守的辅酶结合序列，其催化残基为S134-Y172-K176。酶学性质表征显示，CgADH为非金属依赖酶，最适还原和氧化pH分别为5.0及9.5，最适反应温度为65℃，30℃下半衰期为55h，属于嗜温酶。CgADH的还原底物谱较为宽泛，可催化还原双芳基酮、芳基酮酯、苯乙酮类、杂环酮等多种不同结构酮类底物；对异丙醇和2,3-丁二醇等有较高的氧化活力。 （2）基于序列保守性分析的醇脱氢酶CgADH立体选择性的半理性改造。为探究CgADH的立体选择性机制，基于CgADH与同源酶的结构比对及保守性分析，选取了9个可能影响酶立体选择性的位点进行定点扫描突变。利用三种模式底物（双芳基酮、芳基酮酯、杂环酮）对以上突变酶进行性能测定，发现了影响CgADH对双芳基酮立体选择性的关键位点V222和C244，并获得了立体选择性互补的突变酶C244A和V222G/C244N。最优R-突变酶C244A的催化效率（kcat/KM）提高了71倍，e.e.值为99.6%(R)；最优S-突变酶V222G/C244N催化效率提高了25倍，e.e.值翻转为99.6%(S)，证明了CgADH具有较高的构象可塑性。分子对接和底物谱分析显示，双芳基酮底物结构中氯苯基的取代位置对酶活性及立体选择性影响最大；苯环对位取代基种类对酶活性影响较大，但对立体选择性几乎无影响；吡啶基则对酶活性基本无影响，对立体选择性有一定影响。基于CgADH兼具氧化还原活力，构建了以异丙醇为辅底物的辅酶自循环体系，实现了利用对映互补酶高效催化合成光学纯(R)-和(S)-CPMA。 （3）晶体结构指导的醇脱氢酶CgADH立体选择性的理性设计。为了进一步实现对醇脱氢酶CgADH立体选择性的理性调控，对CgADH进行了晶体结构解析，与来源于Candidaglabrata的对映互补酶CgKR1进行结构比对，建立了底物结合口袋互补工程的立体选择性调控策略，并确定了CgADH对N-Boc-3-哌啶酮（NBPO）的立体选择性开关位点—F173。突变酶F173A的立体选择性由野生酶的99.1%(R)反转为99.9%(S)，催化效率也提高近600倍。进一步通过理性设计强化酶与NBPO之间的作用力，获得了双突变酶V169K/F173A，其催化效率进一步提高至WT的1000倍。基于NBPO及类似物的底物谱，确定了CgADH的173位点对于带有Boc基团底物具有立体选择性开关的调控作用。MD模拟结果与实验结果数据完全吻合，WT-NBPOProR、F173A-NBPOProS以及V169K/F173A-NBPOProS更易形成预反应态。为验证上述立体选择性开关（173位点）的通用性，将其引入CgADH的同源酶（序列相似性50~78%），成功实现了4个同源酶立体选择性的反转，进一步证实了该底物结合口袋互补工程策略的有效性。对反应体系进行优化，基于对映互补酶WT和V169K/F173A在十克级规模实现了不对称还原合成(R)-NBHP和(S)-NBHP，其中V169K/F173A各项催化参数达到规模应用要求。 （4）醇脱氢酶CgADH氧化活性的分子改造及在辅酶再生中的应用。与经典异丙醇脱氢酶相比，CgADH具有较高异丙醇氧化活力（6.5U·mg-1）和较低的丙酮还原活力（1.53U·mg-1），其异丙醇氧化/丙酮还原活力比值为4.25，采用CgADH可有效缓解辅酶循环体系中热力学平衡问题，避免异丙醇的过量添加。对CgADH及同源酶进行醇类底物谱表征，发现CgADH对仲醇类底物活力较高，而其他同源酶如CgKR1对伯醇类底物活力更佳。通过对CgADH进行活性位点组合突变改造获得一系列氧化活力显著提升的突变酶。其中，N93T和C145W/C244L的异丙醇活力及氧化/还原活力比值同时获得提高，可进一步缓解辅酶循环中热力学平衡问题；V169W则可非选择性氧化(S)-1-苯乙醇和(R)-1-苯乙醇；C244T可立体专一性氧化(S)-2-苯乙醇。以上研究极大拓展了醇脱氢酶CgADH在构建高效还原型辅酶循环体系及去消旋化等领域的应用。 本论文针对醇脱氢酶CgADH的立体选择性内在机制展开研究，开发了一种基于底物结合口袋改造酶立体选择性的新策略，并获得了多对对映互补突变酶用于合成不同构型的手性仲醇，使用该策略改造其他醇脱氢酶的立体选择性，证实了其突变策略的普适性。本论文对于同源酶立体选择性的分子改造及不同构型手性仲醇化合物的合成具有指导意义。
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