摘要
目的： 1.验证血管生成素（Ang1）在大鼠脉络膜血管内皮细胞中的最佳浓度，并探究其在体外实验中对大鼠脉络膜血管内皮细胞迁移、血管生成及对细胞间黏附的影响。 2.探究Ang1对激光诱导大鼠脉络膜新生血管（CNV）的治疗作用。 3.探索Ang1治疗脉络膜新生血管的可能机制。 方法： 1.通过细胞活性检测实验测定Ang1的最佳使用浓度，并用此浓度进行细胞实验。设置对照组、VEGF组、VEGF+Ang1治疗组，分别在不同条件下进行培养，使用划痕实验及transwell迁移实验检测细胞的迁移情况，并用管腔形成实验观察新生血管形成的情况，同时用细胞免疫荧光观察细胞间的黏附情况。 2.将30只棕色挪威（BN）大鼠随机分为3组：正常组、模型组、Ang1治疗组10只/组。采用532nm的激光对棕色挪威（BN）大鼠进行视网膜光凝造模，并于造模后14天进行眼底荧光造影检查（fundusfluoresceinangiography,FFA），观察大鼠造模是否成功。对造模成功的大鼠分别进行玻璃体腔注射药物/生理盐水。并于注射后第10天每组取2只大鼠眼球做苏木精-伊红染色(HE染色)切片；对每组3只大鼠进行FITC-dextran心脏灌注及脉络膜铺片，检测CNV的渗漏面积；同时取3只大鼠的RPE-脉络膜-巩膜复合体，用于后续的Westernblotting实验。 3.取对数生长期的RCVECs细胞37℃、5%CO2培养24h，待细胞融合至70%时按照转染试剂操作说明进行细胞转染，设阴性对照组（siRNA-NC组，转染siRNA-NC)、RapGEF1-siRNA组(转染RapGEF1-siRNA)及RapGEF1-siRNA+Ang1组(转染RapGEF1-siRNA)，转染后根据分组在不同培养环境下继续培养24h，提取细胞蛋白及上述组织蛋白进行Westernblotting实验；并用细胞免疫荧光染色对转染后细胞中VE-cadherin进行定量分析。 结果： 通过CCK-8实验可以测出Ang1的最佳浓度为200ng/ml。划痕实验和transwell实验从水平和垂直两个方向证明Ang1治疗组的细胞迁移于对照组无明显差异（pgt;0.05）,但是较VEGF组有明显差异（plt;0.05）；小管形成实验结果显示Ang1治疗组和对照组相比无统计学差异（pgt;0.05）管腔形成较少，较VEGF组有统计学差异（plt;0.05）。细胞免疫荧光定量分析发现Ang1治疗组的钙粘蛋白（VE-cadherin）含量较VEGF刺激组显著增高（plt;0.05），但Ang1治疗组和对照组相比无统计学差异（pgt;0.05） 2.HE染色切片结果显示模型组大鼠视网膜、Bruch膜和RPE层结构紊乱，内、外核层处可见组织构造不连续，并可见异常增生的细胞突破脉络膜血管网的基底膜。Ang1治疗组大鼠视网膜、脉络膜损伤面积及程度较模型组显著减小。脉络膜铺片可以看出相较模型组，Ang1治疗组大鼠CNV渗漏面积显著减小，差异具有统计学意义（plt;0.05）。 3.动物Westernblotting实验结果表明相比正常组，模型组大鼠视网膜-脉络膜中RapGEF1、VE-cadherin蛋白的表达显著降低（均为plt;0.05）；相比模型组，Ang1治疗组大鼠视网膜-脉络膜中RapGEF1、VE-cadherin蛋白的表达显著增高，差异具有统计学意义（plt;0.05）;在三组中，Rap蛋白表达均无差异（pgt;0.05）。转染后RapGEF1-siRNA组RCVECs细胞中RapGEF1、VE-cadherin蛋白表达较siRNA-NC组及RapGEF1-siRNA＋Ang1组明显降低（plt;0.05），细胞免疫荧光结果显示RapGEF1-siRNA组RCVECs细胞中VE-cadherin蛋白荧光量较siRNA-NC组及RapGEF1-siRNA＋Ang1组明显降低（plt;0.05）。 结论： 1.Ang1在不影响内皮细胞正常迁移的情况下可以抑制由于VEGF刺激引起的细胞过度增殖迁移，同时也可以抑制VEGF引起的脉络膜血管内内皮细胞间异常的血管管腔形成。 2.Ang1对大鼠脉络膜新生血管生长有一定的抑制作用，可减少新生血管的渗漏和脉络膜损伤。 3.Ang1在治疗CNV中的作用机制可能是RapGEF1/VE-cadherin途径。
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