摘要
浓香型白酒以泥窖池为发酵容器，以添加了一定量中高温大曲的蒸煮高粱为发酵原料（即酒醅），经多菌种固态发酵而成。酒醅作为白酒酿造过程中微生物的生长基质和白酒呈香呈味物质的直接来源，其微生物群落结构、演替规律及其代谢活动等直接影响白酒的风味与品质。前人对蚕豆酱、奶酪等传统酿造食品的研究显示，开放的生产环境使得它们的发酵微生物群落结构与产品风味易受到季节的影响。前期研究也发现不同季节生产的白酒主体风味物质含量差异显著。然而，目前对季节带来的环境差异对浓香型白酒酿造微生物群落及基酒风味的影响尚缺乏系统研究。 本课题以不同季节浓香型白酒发酵过程的酒醅样品及对应基酒为研究对象，追踪了发酵过程中酒醅基础理化和风味物质的变化规律，应用高通量测序技术分析了酿造微生物群落结构及其演替规律，同时分析了各季节基酒的风味物质，通过多元统计分析对比了不同季节酒醅和基酒风味物质以及酿造菌群结构与功能的差异，结合相关性分析探究不同季节白酒风味差异的酿造微生物基础。本研究有助于加深环境对白酒酿造影响的科学认识，亦可为生产上不同季节酿酒工艺的理性调控提供理论支撑。主要研究结果如下： （1）采集了江苏某浓香型白酒厂4口正常生产窖池的四个季节发酵过程酒醅样品，共160个，分析了酒醅理化性质的变化规律。发酵温度在发酵过程中呈夏季gt;春季gt;秋季gt;冬季，冬季水分增长、总酸积累和糖分利用速度较其他季节迟缓，在21天时水分、总酸和还原糖含量分别为64.99%、3.43mmol·10g-1醅和25.79g·kg-1醅，而其他季节分别在74.27%~76.42%、4.35~4.96mmol·10g-1醅和6.28~14.35g·kg-1醅。采用高效液相色谱（HPLC）分析有机酸变化规律，以乳酸、乙酸和柠檬酸为主，各季节有机酸均随发酵进行逐渐积累，前21天增加迅速，与温度变化规律相符，且第21天时冬季含量最低（39.53g·kg-1醅）。利用顶空固相微萃取-气质联用（HS-SPME-GC-MS）分析比较了各季节发酵酒醅挥发性化合物代谢情况，共检出119种化合物，酯类物质占比最高（57.86%~89.23%），其次为酸类和醇类，挥发性化合物也在前21天迅速积累。偏最小二乘判别分析（PLS-DA）分析表明，各季节挥发性化合物结构差异明显，并筛选出季节关键差异化合物。 （2）采用扩增子测序分析了各季节浓香型白酒发酵过程酒醅中微生物群落结构与演替规律。各季节细菌多样性在前7天上升，第15天显著下降，随后保持稳定，真菌多样性在发酵过程中呈现一定范围内的波动。主坐标分析（PCoA）和置换多元方差分析（PERMANOVA）显示细菌和真菌群落在不同季节间均差异显著（Plt;0.001）。优势细菌属为乳酸杆菌属（Lactobacillus，相对丰度：2.78%~99.96%）、芽孢杆菌属（Bacillus，0.00%~60.06%）和醋酸杆菌属（Acetobacter，0.00%~52.95%）等，各季节变化趋势相似，在15天后乳酸杆菌属占绝对优势，平均相对丰度达96.82%，在ASV水平，主要为金山醋酸乳杆菌（Acetilactobacillusjinshanensis）。优势真菌属为嗜热子囊菌属（Thermoascus，0.00%~89.38%）、曲霉属（Aspergillus，0.35%~74.12%）和哈萨克斯坦酵母属（Kazachstania，0.00%~98.22%）等。相较于其他季节，春季酒醅中嗜热子囊菌属（16.73%~89.38%）相对丰度较高，夏季中假丝酵母属（Candida，2.38%~94.97%）相对丰度较高，秋季中哈萨克斯坦酵母属（0.02%~98.22%）相对丰度较高，冬季中嗜热真菌属（Thermomyces，0.52%~56.41%）相对丰度较高。基于随机森林机器学习方法判定了31个细菌ASV和14个真菌ASV为季节特征微生物。 （3）为了探究不同季节发酵过程中微生物群落的演替机制，RDA分析发现，各季节还原糖与前期细菌群落呈正相关，而总酸、有机酸及水分与发酵后期群落呈正相关。共现性分析显示不同季节微生物相互关系也存在差异，秋冬季有着更复杂的网络模式，更少的负相关边及更多的核心节点。各季节细菌群落组装（assembly）呈现出相似的变化模式，随发酵进行逐渐趋向确定性过程，而真菌群落组装模式没有明显的规律。最后，对功能微生物进行了探索，细菌功能预测分析（Tax4Fun2）表明与白酒四大酸（即己酸、乙酸、乳酸和丁酸）代谢相关的关键酶基因在各季节发酵过程中变化趋势相似。Spearman相关性分析发现各季节中注释为金山醋酸乳杆菌的细菌ASV与大量化合物呈现显著正相关，与春夏季相比，在秋冬季中真菌ASV与较多化合物呈显著正相关（Plt;0.05）。 （4）对各季节浓香型白酒基酒的主体馏段（即除去一段酒头和四段酒尾的二、三段酒）进行了风味物质分析。结果显示，基酒中总酸和四大酸含量在春夏季均高于秋冬季。共检测到108种挥发性化合物，酸类物质含量在春夏季中高于秋冬季，醇类物质含量为春季＞夏季＞秋季＞冬季，醛类在二段酒中随季节呈上升趋势。以挥发性化合物建立不同季节基酒PLS-DA分类模型，分类效果明显，通过筛选出的关键差异化合物发现，春季酿造有利于基酒中正戊酸、己酸等酸类的积累，夏季有利于丁酸乙酯、己酸甲酯等酯类的积累，秋季有利于乙酸乙酯、乙酸丁酯等乙酸酯类的积累，冬季有利于反式-2-癸烯醛等醛酮类物质的积累。
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