摘要
角鲨烯（Squalene）是一种具有全反式线性结构且多不饱和的三萜类化合物。其具有天然的抗氧化和抗癌活性，在食品添加剂、药物递送和皮肤护理等领域具有广泛应用。传统生产角鲨烯的方法包括动植物提取法和化学合成法，其中动植物提取法存在提取步骤繁琐、生产周期长、原材料用量大、成本高等问题；而化学法的合成路线复杂、反应条件严苛，并且会造成较大的环境污染。相比较而言，生物法合成角鲨烯具有生产周期短、绿色环保、提取简便及生产条件温和等优势。本文通过代谢工程手段构建重组酿酒酵母菌株高效合成角鲨烯，为角鲨烯生物合成平台奠定了基础。主要研究结果如下： （1）增强角鲨烯生物合成途径关键酶的表达以提高角鲨烯的积累。首先，通过将角鲨烯生物合成途径中的酶基因单独增强表达，确定角鲨烯合成途径中对角鲨烯浓度影响的关键酶基因。然后，将关键酶基因进行组合增强表达，构建了6株重组酿酒酵母菌株，考察了关键酶的不同组合增强表达对角鲨烯和麦角固醇浓度的影响。研究了角鲨烯环氧酶（ERG1）的启动子改造和点突变对ERG1表达水平的调控。结果表明，角鲨烯合成途径中对角鲨烯浓度影响较大的关键酶基因有：tHMG1、MVD1、ERG20、IDI1、ERG9和ERG8；重组菌株IL、ID、IH、ILD、ILH和ILDH发酵后，菌株IL角鲨烯浓度最高，达到34.0mg/L，而菌株ILDH麦角固醇浓度最高，达到12.2mg/L。利用启动子改造下调菌株IL、ID、ILD、ILH和ILDH的ERG1的表达水平后，重组菌ILp的角鲨烯浓度达到了46.2mg/L，比改造前提高了35.9%。菌株ILDHp的角鲨烯浓度达到了38.6mg/L，比改造前提高了294.3%，并且在24h检测到最高角鲨烯浓度，达到42.9mg/L。在菌株ILp的基础上引入了ERG1突变体构建菌株ILpG30S，菌株ILpG30S的麦角固醇含量较菌株ILp有轻微下降，但角鲨烯浓度并没有得到进一步的提升。 （2）强化角鲨烯合成前体物质的供应促进角鲨烯进一步积累。以构建好的重组菌ILp、ILpG30S和ILDHp作为出发菌株，利用线粒体定位信号肽，将线粒体内的乙酰辅酶A转化为角鲨烯合成前体甲羟戊酸用以合成角鲨烯；分析所构建重组菌株的甲羟戊酸途径（MVA途径）基因的转录水平，通过增加低转录水平基因的拷贝数强化其表达；加强乙醇代谢途径，将乙醇转化为乙酰辅酶A，为角鲨烯的生产提供更多的前体。结果表明，将ERG10、ERG13、tHMG1利用半乳糖启动子在线粒体内增强表达后，成功将线粒体内的乙酰辅酶A引入角鲨烯生产中，构建了线粒体工程重组菌株ILpC、ILpG30SC和ILDHpC，其中重组菌ILDHpC的角鲨烯浓度达到了261.1mg/L（47.1mg/gDCW），较线粒体工程引入前提高了576.4%。进一步将甲羟戊酸途径表达水平低的基因在菌株ILDHpC中增加拷贝数后，并没有对角鲨烯的生产产生明显的影响。通过在重组菌ILDHpC中增强表达ADA和ADH2构建了重组菌株R，有效地将乙醇代谢为角鲨烯生产前体乙酰辅酶A，菌株R角鲨烯最高浓度到达316.1mg/L（56.7mg/gDCW），较ILDHpC提高了20.6%，利用重组菌R获得了无需半乳糖诱导的角鲨烯生产菌RD。 （3）优化角鲨烯高产工程菌的发酵工艺。在摇瓶中通过对碳源种类及浓度、氮源种类及添加比例、金属离子添加浓度的优化，以及5L发酵罐补料分批发酵工艺优化，有效提高了工程菌RD合成角鲨烯的浓度。结果表明，与葡萄糖相比，蔗糖更有利于角鲨烯的积累，最佳添加浓度为60g/L；最佳氮源为蛋白胨和酵母粉混合氮源，并且最佳氮源总浓度为45g/L；添加K2HPO4和MgSO4有利于角鲨烯的合成。在此基础上，利用响应面实验设计法对工程菌RD氮源添加比例和金属离子添加浓度进行了优化，得出最佳氮源添加比例为蛋白胨：酵母粉=4:1，金属离子添加浓度为0.1g/LK2HPO4和0.35g/LMgSO4时，摇瓶水平角鲨烯浓度达到604.8mg/L。以高产工程菌RD为对象，开展了5L发酵罐的工艺研究。当接种量为2%，溶氧控制在40%左右，pH控制在5.8，采用12-48h补加含360g/L蔗糖的补料培养基A，在60-120h补加含50%乙醇的补料培养基B的两阶段补料工艺，角鲨烯的最高浓度达到1929.7mg/L。
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