摘要
柑橘黄龙病菌主要由柑橘木虱Diaphorinacitri以增殖型体内循环式传播，已经肆虐了全球50多个国家，对亚洲、美洲、非洲的柑橘产业都造成了巨大的损失。柑橘木虱通过刺吸寄主植物韧皮部汁液从感染黄龙病的植株中获取病原菌CandidatusLiberibacter,随后，病原菌沿着“口针-中肠-血淋巴-唾液腺”的传输路线在柑橘木虱体内进行转运，最终随唾液的分泌被传播至植物寄主中。在此传输过程，柑橘木虱中肠是病原菌在虫体遇到的第一道屏障，病原菌穿越介体昆虫中肠到达血淋巴的能力与其传播效率密切相关。目前，有研究认为黄龙病病原菌与其他植物病原菌类似，可借助网格蛋白介导的胞吞作用突破柑橘木虱中肠侵染屏障。近年来，有报道发现柑橘木虱取食获菌后，黄龙病病原菌会导致其中肠细胞凋亡，并推测由于病原菌诱发的中肠细胞凋亡导致黄龙病菌突破肠道。然而，后来研究发现黄龙病菌近源菌没有引起介体昆虫肠道凋亡，并认为肠道凋亡不是由于病原菌本身所诱发。针对这种特定现象，有几个重要的科学问题需要回答:究竟柑橘木虱肠道细胞凋亡是哪些因子导致，而肠道细胞凋亡是否为病原菌突破肠道进入血淋巴的另一种模式？ 为了探究这两个关键科学问题，本研究将利用广泛靶标代谢组研究感染黄龙病和健康柑橘的次生物质差异，通过夹膜饲喂法筛选可诱导木虱肠道细胞凋亡的次生物质。在明确特定次生物质基础上，利用靶向代谢组分析是否黄龙病侵染后特异引起化合物合成和累积，通过酵母双杂交和过表达技术研究黄龙病关键因子对植物特定次生物质合成和累积调控作用。主要研究内容及结果如下: （1）利用广泛靶标代谢组对感染柑橘黄龙病和健康砂糖橘的叶片进行检测，共检测到1096种代谢物，其中差异代谢物有185种;相比健康叶片，感病叶片有82种次生物质增加，有83种次生物质减少。这些差异化合物大部分属于氨基酸及其衍生物、酚酸类、黄酮类、生物碱及脂质;小部分差异化合物属于核苷酸及其衍生物、醌类、木脂素和香豆素、鞣质、萜类和甾体。 （2）利用夹膜饲喂法分析不同候选次生物质对柑橘木虱肠道凋亡影响，发现只有次生物质T1874可以诱发木虱中肠细胞凋亡。通过多项细胞凋亡研究，其中包括Caspase-3免疫荧光、ROS、TUNEL、Caspase-3酶活力多项检测方法，均证明T1874可以促使木虱细胞凋亡。更重要的是，通过传菌试验测定发现，预先取食T1874的木虱再次刺吸带病叶片会导致木虱中肠的黄龙病菌量下降，而柑橘木虱整虫的含菌量则上升。 （3）利用靶向代谢组研究不同柑橘品种在黄龙病侵染后、柑橘在不同生物或非生物胁迫下T1874含量，发现黄龙病侵染不同柑橘品种均可导致T1874含量明显增加，但只有黄龙病侵染后才特异诱导T1874含量上调，而其他不同胁迫条件下不会诱导T1874含量上升。另外，通过检测感染黄龙病和健康柑橘叶片在不同发育过程中T1874物质含量变化，发现随着叶片成熟T1874逐步累积上升，而黄龙病侵染会加速其含量上升。由此，推测黄龙病侵染会特异地诱导次生物质T1874上调，并且有可能通过黄龙病特定因子进行调控。 （4）为了探明黄龙病特定因子对次生物质调控作用，先对感病柑橘中黄龙病菌分泌蛋白进行表达分析，筛选出叶片中高表达的分泌蛋白CLIBASIA_03230。然后，以CLIBASIA_03230作为诱饵蛋白从柑橘酵母双杂文库中筛选出植物互作蛋白，发现30个潜在互作蛋白。继而利用酵母双杂、免疫共沉淀、GSTpull-down验证发现CLIBASIA_03230与柑橘转录因子TIFY10A、WRKY9存在明显互作。在此基础上，通过转基因和野生型拟南芥表型观察，发现WRKY9转基因植物表现出加速发育和衰老，并且植物次生物质T1874明显增加。 综上所述，本研究发现了黄龙病侵染可特异诱导次生物质产生和累积，在木虱取食带病叶片时，将黄龙病菌和次生物质一同摄入，次生物质会诱导中肠细胞凋亡,促进黄龙病菌突破第一道物理屏障。而黄龙病菌可能通过分泌蛋白CLIBASIA_03230操纵叶片发育和成熟，加速植物次生物质T1874的产生和累积。这些新的发现不仅提升了黄龙病菌-柑橘-柑橘木虱三者互作关系的认知，为深入研究黄龙病病原菌虫体扩散的分子机制提供重要信息。
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