摘要
西瓜(Citrulluslanatus)是重要的葫芦科经济作物，果肉中含有多种类胡萝卜素，赋予了西瓜丰富的果肉颜色。Psy(PhytoeneSynthase)编码类胡萝卜素合成过程中的限速酶:八氢番茄红素合成酶，是类胡萝卜素代谢通路中的关键基因。β-胡萝卜素是维生素A合成的前体物质，在促进入体健康方面具有重要作用。课题组前期以浅黄色果肉COS和橙色果肉PI192938配制遗传群体，精细定位并克隆了调控β-胡萝卜素合成的关键基因ClPsy1,并推测ClMYB21(Cla97C10G196920)可能是调控ClPsy1表达的关键调控因子。在上述研究基础上，本试验选取四种不同果肉颜色西瓜种质:浅黄色果肉COS(CreamofSaskatchewan)、亮黄色果肉PI635597、橙色果肉PI192938和红色果肉LSW-177,根据已发表的RNA-seq数据和qRT-PCR技术分析ClPsy1和ClMYB21的表达模式。构建VIGS(病毒诱导的基因沉默，Virusinducedgenesilencing)沉默载体转化番茄果实，初步探究ClMYB21的功能。构建ClPsy1启动子-GUS缺失片段表达载体瞬时转化番茄果实，分析番茄果实中β-葡萄糖苷酸酶(β-glucuronidase,GUS)活性的表达情况，判断ClPsy1启动子活性关键作用区间。以富含β-胡萝卜素的橙色果肉西瓜PI192938为受体材料，优化西瓜再生体系;构建ClPsy1基因CRISPR/Cas9基因编辑载体，转入发根农杆菌K599,检测靶位点敲除效率，为后续西瓜遗传转化试验提供载体基础，本研究得到的主要结果如下: (1)结合RNA-seq显示ClMYB21与ClPsy1表达趋势相同，与果皮组织相比ClMYB21在果肉组织中特异性表达，其表达量与类胡萝卜素含量相关。 (2)构建VIGS表达载体，在番茄果实中瞬时沉默ClMYB21的同源转录因子SlMYB21后，果实中类胡萝卜素积累受到明显影响，而未处理番茄则可正常转色，且沉默后番茄果实中SlMYB21和SlPsy1的表达量均显著下降。推测ClMYB21转录因子会影响ClPsy1的表达,参与果肉类胡萝卜素的合成。 (3)在四份不同果肉颜色西瓜材料中克隆ClPsy1启动子，并进行序列及结构差异比对，结果显示浅黄色果肉COS中有不同于其它三个品种的6处SNPs(第342th、598th、898th、1,257th、1,634th和1,694th位)，其中598th位为T→C突变，导致MYC转录因子结合位点的突变，1257th位为T→C突变，导致MYB转录因子结合位点的突变。 (4)构建缺失片段对启动子活性分析结果发现，ClPsy1启动子可以驱动GUS基因表达，橙色果肉PI192938的启动子活性高于浅黄色果肉COS;GUS基因表达活性在启动子1521bp至1043bp出现差异，推测ClPsy1启动子的活性相对较强的主要范围为-1521～-1043bp,在此区间内存在MYB转录因子结合位点的改变。 (5)橙色果肉西瓜PI192938再生体系的最佳外植体为子叶基部，优化后再生体系所用培养基的最适配比如下，不定芽分化培养基:MS+1.0mg/L6-BA+2.0mg/LAgNO3+30g/L蔗糖+8g/LAgar;芽伸长培养基:MS+0.2mg/LKT+30g/L蔗糖+8g/LAgar;生根培养基:MS+0.5mg/LNAA+30g/L蔗糖+8g/LAgar,约60天左右能形成完整再生植株。 (6)构建了CRISPR/Cas9基因编辑双靶点载体通过发根农杆菌K599侵染PI192938子叶节，测序结果显示与野生型材料相比，编辑后的材料在ClPsy1基因组层面上产生了285bp-695bp的片段缺失，成功实现了在西瓜不定根中的编辑，说明本试验构建的基因编辑载体靶位点正确，可以用于后续基因编辑试验。证明诱导基因编辑不定根检测靶位点敲除是检验CRISPR/Cas9系统靶位点的有效方法。
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