摘要
大豆(GlycinemaxL.)是重要的粮食和经济油料，大豆花叶病毒(Soybeanmosaicvirus,SMV)的侵袭会造成大豆产量和品质的严重损失。一般情况下，病毒组分蛋白和寄主蛋白协同作用实现病毒侵染。同时有些宿主蛋白可以通过识别病毒蛋白来完成宿主免疫，因此对于病毒成分蛋白与宿主互作蛋白的研究具有重要意义。SMV基因组编码11个蛋白，其中P1、P3、CI、HC-Pro及6K2参与了病毒的运动、复制及传播。本论文利用酵母双杂交技术，构建了上述SMV五个组分蛋白的诱饵载体，筛选了大豆cDNA文库中的互作蛋白，分别得到了10个P1候选互作蛋白、17个P3候选互作蛋白、25个CI候选互作蛋白、31个6K2候选互作蛋白以及8个HC-Pro候选互作蛋白。通过多组学联合分析及结构域的功能预测，结合文献报道挑选出了其中5个宿主蛋白:GmGIP2(ProbableasparticproteinaseGIP2)、GmSTOP1(Sensitivetoprotonrhizotoxicity1)、GmRPS6(RibosomalproteinS6)、GmNTM1(NACwithtransmembranemotif1)及GmSRC2(Soybeangeneregulatedbycold2),并对其进行了互作与功能研究。主要研究结果如下: (1)克隆P1、P3、CI、HC-Pro及6K2的编码基因，分别构建重组pGBKT7诱饵载体在大豆cDNA文库中进行互作蛋白筛选，对QDO平板上生长的阳性克隆测序并进行大豆基因组的blast比对。通过开放数据库的转录组数据挖掘、GO、KEGG、结构域预测及蛋白互作网络构建等方法对筛选到的互作蛋白进行了生物信息学分析。GO分析结果表明大多互作蛋白主要存在于细胞膜、细胞核及叶绿体，具有金属离子结合、催化活性、DNA结合等分子功能。并参与了运输、代谢、光合作用、DNA转录模板调控等生物学过程。KEGG分析表明多数候选互作蛋白参与了光合作用、碳代谢、抗原传递和加工等信号通路。在转录组数据中分析了SMV接种大豆后目的基因的动态表达水平。通过构建蛋白互作网络证实了候选蛋白不仅与SMV组分蛋白互作，候选蛋白之间同样存在互作关系。将所有候选互作蛋白构建互作网络交叉分析后发现了一个蛋白CSN5(COP9signalosomecomplexsubmit5),其与病毒蛋白P1、P3、CI及HC-Pro均存在互作关系，且与GmSTOP1、GmHAT22(Homeobox-leucinezipperproteinHAT22)和GmRPS6均存在可能的互作关系。 (2)病毒的传播与复制在病毒侵染过程中至关重要。蚜虫传播是SMV感染寄主的主要方式，而HC-Pro在介导蚜传中发挥重要作用。6K2介导病毒和寄主细胞膜的结合，参与病毒复制。因此，从所有互作蛋白中我们重点分析了6K2和HC-Pro的互作蛋白。其中，GmGIP2、GmNTM1、GmRPS6、GmSRC2及GmSTOP1的同源基因曾被报道与植物免疫反应有关。因此对其进行了进一步的互作验证与功能研究。酵母双杂交结果表明GmGIP2与HC-Pro互作，GmNTM1、GmRPS6、GmSRC2及GmSTOP1与6K2互作。在抗性功能上，通过5个基因在本氏烟草瞬时表达体系中与大豆花叶病毒侵染性克隆SMV-GFP的共表达，证实了GmGIP2与GmSTOP1对SMV存在抗性，而GmNTM1、GmRPS6和GmSRC2对SMV不存在直接的抗性。 (3)上述实验中证实了GmSTOP1和GmGIP2对SMV具有部分抑制作用。因此对GmGIP2和GmSTOP1的抗性机制进行了进一步研究。HC-Pro和6K2识别其相应互作蛋白GmGIP2与GmSTOP1,导致GmGIP2与GmSTOP1的抗病毒活性减弱。GmGIP2、GmSTOP1与SMV-GFP在底叶的表达与分段侵染均证明其能够抑制SMV的扩散。通过亚细胞定位对两个基因发挥功能的位置进行了检测，结果显示,GmGIP2定位于细胞膜，GmSTOP1定位于细胞核。双分子荧光互补(BimolecularFluorescenceComplementation)的结果显示GmGIP2与HC-Pro的互作位置在细胞膜上，GmSTOP1与6K2的互作位置在细胞核内，这与它们的亚细胞定位相一致。综上所述，我们推测大豆GmGIP2和GmSTOP1分别通过识别SMV的HC-Pro和6K2来介导对该病毒的抗性。
NETL