摘要
研究背景：胸腺是人的机体中最早出现衰老的器官之一。胸腺上皮细胞（thymicepithelialcells，TECs）作为胸腺微环境的重要组成成分，是机体能够产出功能正常的T细胞的必需抚育细胞，而随年龄增长，TECs数量减少，功能减退，正常T细胞产出减少，机体免疫功能衰退，抗肿瘤能力变弱，如何减缓这一过程，增强抗肿瘤能力，成为研究热点。 目的：探究利用Cre-Loxp技术构建的TECs条件性敲除糖原合成激酶3β（glycogensynthasekinase-3β,GSK-3β）基因的衰老中小鼠的胸腺上皮细胞各亚群的数量变化、以及相关功能分子变化、胸腺淋巴细胞亚群的数量变化、脾脏及外周血中各淋巴细胞亚群的数量变化，观察TECs条件性敲除GSK-3β基因小鼠的抗肿瘤能力，明确其与野生型（Wildtype,WT）小鼠抗肿瘤能力的区别，探究其机制，为临床上通过延缓胸腺功能衰退从而增强机体的抗肿瘤免疫提供思路及实验依据。 方法：将C57BL/6J背景的GSK-3βfloxp（GSK-3βf）小鼠与FoxN1cre小鼠配对，繁殖的后代用DNA凝胶电泳进行基因型别鉴定，将鉴定出的不同基因型别的小鼠进行分组。GSK-3βf/fFoxN1cre为条件性敲除（Conditionalknockout,cKO）小鼠组，同窝的其它型别的WT小鼠为对照组。将对应数量cKO小鼠以及WT小鼠分别用角蛋白5（Keratin5,K5）、角蛋白8（Keratin8,K8）、GSK-3β及Ki67等荧光抗体对胸腺进行染色，用激光共聚焦荧光扫描显微镜（Confocal）观察胸腺组织结构及K5、K8、GSK-3β、Ki67等蛋白的表达情况。从而通过荧光叠加图的GSK-3β蛋白的表达位置进一步确定cKO小鼠和WT小鼠的区别，之后用流式细胞术（FlowCytometry，FCM）检测6周（Weeks,w）龄、6月（Months,m）龄、12m龄、24m龄小鼠TECs、胸腺细胞及其亚群、脾脏及外周血中的淋巴细胞及其亚群，及相关细胞因子的变化。将12m龄小鼠进行胰腺肿瘤PAN02细胞皮下荷瘤，观察体重、肿瘤体积变化，在实验终点处死小鼠，FCM检测肿瘤组织浸润性的T细胞及相关细胞因子的变化。将荷胰腺肿瘤小鼠脾脏淋巴细胞与Pan02肿瘤细胞及B16F10黑色素瘤细胞分别共培养，48小时（Hours,h）后，检测淋巴细胞及其亚群的比例、分泌细胞因子和杀肿瘤能力的情况。 结果：DNA凝胶电泳可以清楚分辨出小鼠的基因型别，Confocal观察到GSK-3β在K5+及K8+的细胞上不表达（K5、K8分别在皮质TECs和髓质TECs上表达）即TECs条件性敲除GSK-3β基因小鼠构建成功，且基因敲除小鼠TECs的Ki67表达更高，其胸腺体积显著增大，无明显脂肪浸润。FCM结果表明：cKO小鼠TECs及胸腺上皮祖细胞（earlythymicprogenitorcell,TEPC）数量增多，TECs的Aire，CD80表达增强；胸腺细胞及各亚群数量明显增多；cKO小鼠与WT小鼠相比较脾脏及外周血中的各淋巴细胞亚群数量明显增多；抗肿瘤的细胞因子IL-2、IFN-γ、TNF-α增多，促肿瘤的细胞因子IL-10、TGF-β减少。12m龄cKO小鼠与同发育阶段的WT型小鼠相较，所荷胰腺肿瘤生长更缓慢。FCM检测cKO小鼠与WT小鼠肿瘤微环境中各淋巴细胞数量，发现肿瘤组织浸润性的T细胞比例增加、多种免疫细胞分泌的抗肿瘤细胞因子增多、淋巴细胞表面活化分子表达增强。将荷胰腺肿瘤之后的cKO小鼠和WT小鼠的脾脏淋巴细胞在体外分离出来与Pan02肿瘤细胞及B16F10黑色素瘤细胞共培养，发现cKO小鼠的共培养体系中各淋巴细胞亚群数量增多，抗肿瘤的细胞因子分泌增多，促肿瘤的细胞因子分泌减少，CD8+T淋巴细胞及其分泌颗粒酶B（GranzymeB,Gzb）增多。 结论：cKO小鼠与WT小鼠相比较，在衰老进程中，TECs数量更多功能更强，能产出更多成熟T细胞，具有更强免疫功能。衰老阶段的TECs条件性敲除GSK-3β基因小鼠抗肿瘤能力明显强于野生型同发育阶段小鼠。这为临床上延缓胸腺衰老来达到抗肿瘤目的提供了相应思路。
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