摘要
硒(Selenium,Se)在调节人和动物健康方面发挥着不可或缺的作用，机体缺硒会造成多种器官和组织功能的失调与损伤，例如炎症、凋亡、坏死和自噬等。肺脏作为硒缺乏的靶器官之一，许多研究表明，硒缺乏时动物机体肺部会发生炎性损伤导致肺炎。但是目前缺硒造成的这些肺脏损伤具体机制的报道仍然不足。TLR4作为机体固有免疫系统主要的受体之一，在肺炎发生时起到重要的调节作用。同时，由于程序性坏死的膜破裂特性，其释放的物质与肺炎发展的进程密切相关。为了探究肉鸡缺硒时肺炎的发生机制与TLR4及程序性坏死之间的关联，本试验通过建立鸡缺硒性肺炎模型和鸡胚原代肺泡Ⅱ型上皮细胞缺硒模型进行研究。对鸡肺脏组织进行H&E染色观察其形态学变化，通过流式细胞术和AO/EB荧光染色观察肺泡Ⅱ型上皮细胞的程序性坏死。使用氧化应激试剂盒与ROS染色检测氧化应激相关指标。使用qRT-PCR和WesternBlot方法检测TLR4/NF-κB信号通路、程序性坏死、热休克蛋白、炎症相关基因、硒蛋白与能量代谢相关基因的表达。在体外，使用两种浓度TLR4抑制剂(TAK242)观察肺泡Ⅱ型上皮细胞损伤的变化情况。本试验从分子生物学方面探究缺硒肉鸡肺脏损伤的机制，研究结果如下: (1)H&E染色观察结果表明，NC组肺脏肺泡结构明显，肺泡细胞边界清晰，染色均匀,肺间质无明显充血。-Se组可见肺组织充血，肺泡及组织间隙显著出血、充满大量血细胞，炎性细胞浸润明显，细胞发生坏死，核固缩或溶解消失，肺泡细胞边界不清。这些结果说明硒缺乏能够引起鸡肺脏组织产生炎性损伤。 (2)检测鸡肺脏组织与肺泡Ⅱ型上皮细胞中20种硒蛋白DIO1、DIO2、DIO3、TXRND1、TXRND2、TXRND3、GPX1、GPX2、GPX3、GPX7、SELH、SELO、SELM、SELK、SELS、SEP15、SPS2、SEPP1、SEPX1和SELU的表达水平。缺硒鸡肺脏组织中17种硒蛋白的表达显著下调，缺硒肺泡Ⅱ型上皮细胞中18种硒蛋白的表达显著下调(P＜0.05),表明硒缺乏显著影响了鸡肺脏组织与肺泡Ⅱ型上皮细胞中硒蛋白的表达量。 (3)鸡肺脏组织与肺泡Ⅱ型上皮细胞的氧化应激的检测结果表明，与NC组相比，-Se组的T-AOC、SOD、CAT和GSH-Px的活性降低，MDA与H2O2的含量上升。同时肺泡Ⅱ型上皮细胞ROS检测结果显示，-Se组较NC组绿色荧光亮点数量增多，荧光强度显著增加，表明硒缺乏会引起鸡肺脏组织发生氧化应激。 (4)鸡肺脏组织和肺泡Ⅱ型上皮细胞的TLR4/NF-κB通路的相关基因检测结果显示，与NC组相比较，-Se组TLR4、MyD88、TRAF6和NF-κB的mRNA和蛋白表达均显著增加(P＜0.05)。然而，相比于-Se组，-Se+10nMTAK242组上述基因表达则被明显逆转，并且当抑制剂浓度升高到100nM时，上述检测指标进一步降低(P＜0.05)。上述结果表明，硒缺乏会通过TLR4激活MyD88/TRAF6/NF-κB通路的表达。 (5)鸡肺脏组织与肺泡Ⅱ型上皮细胞程序性坏死相关基因表达检测结果表明，与NC组相比，-Se组RIPK1、RIPK3和MLKL的mRNA和蛋白表达均显著增加。应用流式细胞术和AO/EB染色评估肺泡Ⅱ型上皮细胞程序性坏死的发生。与NC组相比，-Se组细胞坏死率上升,而加入TLR4抑制剂后，细胞坏死率有所下降，并且这种抑制作用随抑制剂浓度上升而效果增强。上述结果表明，硒缺乏通过TLR4信号通路引起鸡肺脏组织发生程序性坏死。 （6）鸡肺脏组织和肺泡Ⅱ型上皮细胞的热休克蛋白及能量代谢相关基因表达的检测结果表明，与NC组相比，-Se组HSP60、HSP70和HSP90的mRNA和蛋白表达水平均显著增加。加入TAK242后，上述检测指标表达进一步降低（P＜0.05）。与NC组相比，-Se组ACO2、HK1、HK2、PFK、PK、SDHB、LDHA的mRNA表达均显著降低。然而，加入TAK242后上述检测指标的表达则有所回升（P＜0.05）。这些结果表明，硒缺乏通过TLR4信号通路引起热休克蛋白表达增加和能量代谢障碍。 （7）鸡肺脏组织和肺泡Ⅱ型上皮细胞的炎症相关基因表达的检测结果表明，与NC组相比，-Se组IFN-γ、PtGEs、COX-2、TNF-α、IL-1β和IL-6表达显著增加（P＜0.05）。细胞试验中加入TAK242后，显著下降了上述基因的表达（P＜0.05）。该结果表明，硒缺乏诱导了鸡肺脏组织的炎性损伤。 综上所述，硒缺乏通过ROS/TLR4/NF-κB信号通路激活热休克蛋白、引发能量代谢障碍,调控鸡肺上皮细胞程序性坏死诱发肺炎。本研究首次阐述了硒缺乏引发鸡肺炎的分子机制，为肺炎的药物研发提供了新的方向。
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