摘要
半夏Pinelliaternata(Thunb.)Breit.为天南星科半夏属多年生草本药用植物，以干燥块茎入药。植物病害是药用植物栽培过程中常见问题之一，严重影响中药材产量及质量。半夏作为常用大宗中药材，随着近年来人工种植面积逐年扩大、种植年限逐年增长，其病害情况日益严重，严重制约半夏产业的发展。然而现有关于药用植物病害的研究较为浅表，尤其是半夏病害相关研究报道极少。因此，对半夏病害进行系统性研究迫在眉睫，为病害绿色防控奠定基础，促进半夏产业的可持续发展。 目的:本研究对半夏全国各主产区软腐病发生为害情况进行调查，对各主产区的病原菌进行分离鉴定、生物学特性测定、室内药剂筛选试验，找出半夏软腐病病原菌、确定病原菌最适生长条件及筛选高效绿色杀菌剂，为半夏软腐病防治提供科学理论依据。 方法:1.对我国各半夏基地软腐病发生情况进行调查并采集病株，按照常规组织分离法进行病原菌分离纯化，利用形态学及分子鉴定法对病原菌进行鉴定。根据柯赫氏法则，通过离体回接及活体回接试验对分离病原菌进行致病力测定以确定其致病性。 2.对半夏进行病原菌活体回接、块茎回接以及在不同温度处理下离体回接对三种半夏软腐病病原菌致病力进行系统比较，并测试了在不同温度和pH下三种病原菌的生长活性。 3.选取了26种药剂对半夏软腐病3种病原菌Dickeya.fangzhongdai、Pectobacterium.aroidearum及Pectobacterium.carotovorum进行药剂筛选，在此基础上筛选出3种效果较为明显的药剂，并设置浓度梯度以探索不同药剂浓度下各药剂对半夏软腐病的室内毒力效果。通过室内筛选药剂得到防治半夏软腐病药剂，设计盆栽防效试验和大田防效试验探索半夏绿色生态种植模式。 4.选取半夏软腐病病原菌中P.aroidearum菌和P.carotovorum菌，采用高通量测序平台对P.aroidearum菌和P.carotovorum菌侵染后的半夏进行转录组测序，筛选处理后差异倍数|log2FC|≥1的差异表达基因（DEGs）进行GeneOntology（GO）富集分析，随后对具有显著性差异表达基因深入探究并进行RT-qPCR验证。 结果:1.半夏软腐病在不同主产区发生病害情况及病原菌种类存在差异。对全国4省（贵州省、湖北省、河北省、甘肃省）6个不同基地进行病害调查，结果显示，半夏软腐病多发生在6～9月，其致病菌被鉴定为P.aroidearum、P.carotovorum、D.fangzhongdai,其中贵州地区优势菌群为P.aroidearum、湖北地区优势致病菌群为Dfangzhongdai、甘肃和河北地区优势菌群为P.carotovorum。 2.确定不同半夏软腐病病原菌致病力强弱及最适生长条件。三种半夏软腐病病原菌中P.carotovorum的致病力最强，D.fangzhongdai其次，P.aroidearum最弱。同时半夏叶片背面更易被半夏软腐病病原菌侵染;高温和低温都不利于3种软腐病致病菌生长，3种软腐病致病菌的适宜生长温度在25～30℃;P.aroidearum的活力更旺盛，明显高于其他两类菌;P.carotovorum对碱性环境更敏感，在强碱性环境下，生长速率较其他菌下降更明显。 3.通过室内药剂抑制三种半夏软腐病病原菌试验筛选出综合效果较好杀菌剂有二氯异氰尿酸钠、噻霉酮和乙蒜素，并进行盆栽和田间试验，发现半夏种植前进行种茎消毒可在不影响半夏生长的同时,降低软腐病发病率。经室内杀菌剂筛选实验可知，植物源杀菌剂乙蒜素对三种半夏软腐病病原菌毒力最强，化学杀菌剂二氯异氰尿酸钠和噻霉酮对软腐病病原菌毒力次之;生产上半夏种植前进行种茎消毒可在不影响半夏出苗情况和生长指标的同时，降低半夏软腐病的发生并增加半夏产量，其中使用0.4％甲醛和乙蒜素对半夏种茎进行消毒后防治效果最好。 4.P.aroidearum菌和P.carotovorum菌激活的半夏免疫应答机制有所不同。用P.aroidearum菌和P.carotovorum菌诱导半夏叶片后，进行RNAseq测序分析。结果表明，P.aroidearum菌诱导半夏1968个转录本上调表达，570个转录本下调表达，P.carotovorum菌诱导半夏中1339个转录本上调表达，662个转录本下调表达。在两种菌共同调控的差异表达基因中，参与细胞壁生物合成和运输过程的基因明显上调。同时，P.carotovorum菌特异性诱导398个基因下调，707个基因上调，P.aroidearum菌特异性诱导1340个基因上调，308个基因下调。两种病原菌可激活不同的激素信号响应基因，P. carotovorum可特异性诱导生长素相关基因上调表达，P.aroidearum特异性诱导赤霉素和乙烯响应基因上调表达。同时12-GDSL酯酶/脂肪酶基因和3-类成束蛋白阿拉伯半乳聚糖蛋白基因在P.carotovorum菌诱导下特异性上调表达，这些基因主要与植物生长发育相关。而而P.aroidearum可特异性诱导受体激酶、抗性相关基因等上调表达，主要与植物免疫有关，这可能是P.aroidearum引起病症较轻的原因。 结论:通过对全国半夏主产区软腐病病害情况进行调查，发现半夏软腐病在全国产区普遍发生。对半夏软腐病菌进行分离鉴定及病原菌致病力比较，发现各半夏主产区软腐病致病菌种类和致病力大小存在差异，3种软腐病病原菌均喜暖喜碱，因此在半夏生产上对软腐病进行防治除了要根据当地气温变化施放适宜农药、减少土壤连作外，种植前需对半夏种茎及土壤进行消毒处理，注意适量施肥，防止土壤碱化。通过对软腐病菌侵染半夏叶片进行转录组学分析，结果表明P.aroidearum菌和P.carotovorum菌可共同调控细胞壁相关基因的表达外，还可特异性诱导不同免疫途径的基因表达。
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