摘要
研究背景 绝经后骨质疏松(Postmenopausalosteoporosis,PMOP)是因内源性雌激素水平下降，导致骨代谢失衡、骨量减少、骨折易感性增加的全身性骨骼疾病，严重威胁着人们的身体健康。在中国，预计到2050年PMOP发病率高达50％～70％。临床对于PMOP的治疗主要有雌激素、双膦酸盐类药物等，长期使用会增加中风、乳腺癌等疾病的患病风险，严重制约了治疗效果，影响患者的生活质量。因此，探索新的药物来治疗PMOP尤为必要。 中药以其疗效好、副作用小、经济实用等优点，越来越广泛地应用于疾病的临床治疗中。中医长期临床实践和研究发现“补肾填精”经典名方六味地黄丸(LiuweiDihuangPills,LWDH)对于PMOP防治具有显著疗效，但是对于LWDH防治PMOP的机制仍不清楚。因此，深入探究LWDH的作用靶点和作用环节，对推广使用LWDH防治PMOP具有重要的临床意义。 研究目的 本实验选用雌性卵巢摘除(Ovariectomy,OVX)大鼠构建骨量丢失模型进行动物实验和D-半乳糖(D-gal)构建衰老细胞模型进行细胞实验，探究LWDH治疗PMOP的机制是否与LWDH促进骨髓间充质干细胞(Bonemarrowmesenchymalstemcells,BMSCs)中YAP(Yes-associatedprotein)的表达，维持自噬，抑制BMSCs衰老相关。通过探讨LWDH调节YAP-自噬轴延缓BMSCs衰老的分子机制，为LWDH治疗PMOP提供重要的实验依据。 研究内容与方法 第一部分 1.体内实验证实LWDH对OVX大鼠骨量流失的影响 运用Micro-CT实验检测LWDH对OVX大鼠股骨骨量和骨参数的影响。 2.LWDH对OVX大鼠股骨骨小梁的影响 H&E和免疫组织化学染色实验检测LWDH对OVX大鼠股骨骨小梁的影响和骨小梁周围成骨相关RUNX2的表达情况。 3.LWDH对OVX大鼠BMSCs成骨能力和成脂能力的影响 运用碱性磷酸酶(ALP)染色及活性测定、油红O染色和实时荧光定量多聚核苷酸链式反应(Quantitativerealtimepolymerasechainreaction,qRT-PCR)实验检测LWDH对OVX大鼠BMSCs成骨分化和成脂分化相关基因表达水平的影响。 4.LWDH对OVX大鼠BMSCs的影响 运用细胞增殖实验(CellCountingKit-8,CCK-8)、β半乳糖苷酶染色实验(senescence-associatedβ-galactosidase,SA-β-Gal)、qRT-PCR实验和蛋白免疫印迹法实验(Westernblot,WB)检测LWDH对OVX大鼠BMSCs增殖能力和衰老情况的影响。 5.LWDH对OVX大鼠BMSCs中YAP和自噬水平的影响 通过qRT-PCR和WB检测LWDH对OVX大鼠BMSCs中YAP和自噬相关基因和蛋白表达的影响。 第二部分 1.体外构建BMSCs衰老模型 使用不同浓度的D-gal干预BMSCs,检测细胞活力，构建衰老BMSCs模型。 2.LWDH对衰老BMSCs中YAP和自噬水平的影响 将BMSCs分为4组:Vehicle组，Aging组，HRS组，VP组。Vehicle组:正常培养BMSCs,Aging组:正常培养BMSCs+50g/LD-gal,HRS组:正常培养BMSCs+50g/LD-gal+10％高剂量六味地黄丸含药血清，VP组:正常培养BMSCs+50g/LD-gal+2.5μMVerteporfin(YAP抑制剂)+10％高剂量六味地黄丸含药血清，以上各组同时培养48h,通过WB和免疫荧光染色(Immunofluorescence,IF)检测YAP和自噬相关蛋白的表达水平，以证实LWDH通过调节YAP-自噬信号途径改善BMSCs的衰老。 3.LWDH对衰老BMSCs增殖和衰老的影响 按照上述处方式处理细胞，运用BrdU掺入实验、SA-β-Gal实验和WB实验检测LWDH对衰老BMSCs增殖和衰老的影响。 4.LWDH对衰老BMSCs成骨分化和成脂分化的影响 按照上述处方式处理细胞，分别进行成骨诱导分化4天、成脂诱导分化14天，通过ALP染色和油红O染色实验检测LWDH对衰老BMSCs的ALP活性和脂肪细胞数量情况的影响;通过qRT-PCR检测LWDH对衰老BMSCs的成骨分化和成脂分化相关基因表达情况的影响。 研究结果 第一部分 1.LWDH可以减轻OVX大鼠引起的骨量丢失，使股骨骨量明显增加，骨参数明显改善，使骨小梁周围成骨相关RUNX2蛋白表达水平显著升高;骨髓腔内脂肪细胞数量和密度明显减少。 2.LWDH可以增强OVX大鼠体内BMSCs的ALP活性，上调成骨分化标志基因Runx2、Osterix和Ocn的mRNA表达水平;减少脂肪细胞的生成，下调成脂分化标志基因Adiponectin、Pparγ和C/ebpα的mRNA表达水平。 3.LWDH可以促进OVX大鼠BMSCs增殖，降低衰老细胞比率，下调衰老相关p53和p21的表达水平。 4.LWDH上调OVX大鼠BMSCs中YAP、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Beclin1的蛋白表达水平，降低p62的蛋白表达水平。 第二部分 1.CCK-8结果表明，经不同浓度的D-gal干预48h后，浓度为50g/L的D-gal使细胞活力明显下降。 2.LWDH可以上调衰老BMSCs中YAP和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Beclin1的表达，下调p62的表达，抑制YAP后，LWDH对衰老BMSCs中YAP、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1和p62的表达未起到显著作用。LWDH可以上调衰老BMSCs中YAP和LC3的表达，且YAP和LC3呈正相关。抑制YAP后，LWDH对衰老BMSCs中YAP和LC3未起到显著作用。 3.LWDH处理衰老BMSCs后，BrdU阳性细胞明显增加，衰老细胞比率明显减少，衰老相关p53、p21的蛋白表达水平表达明显降低;抑制YAP后，BrdU阳性细胞明显减少，衰老细胞比率明显增多，衰老相关p53、p21的蛋白表达水平明显增加。 4.LWDH处理衰老BMSCs后增强ALP染色和ALP活性，上调成骨分化标志基因Runx2、Osterix和Ocn的mRNA表达水平;减少脂肪细胞数量，下调成脂分化标志基因Adiponectin、Pparγ和C/ebpα的mRNA表达水平。抑制YAP后，ALP染色和ALP活性减弱，成骨分化标志基因Runx2、Osterix和Ocn的mRNA表达水平下降;脂肪细胞数量增加，成脂分化标志基因Adiponectin、Pparγ和C/ebpα的mRNA表达水平上升。 结论 本研究表明，LWDH可以通过激活YAP维持自噬延缓BMSCs衰老，促进BMSCs的成骨分化，抑制成脂分化，来发挥治疗PMOP的作用。
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